¿Se puede agitar y mezclar el ARN después de la dilución?
Sí. 1. Preparación
_ Homogeneizador de vidrio, preenfriamiento de etanol 75_, preenfriamiento por centrifugación a 4 ℃, encender la lámpara ultravioleta del banco de trabajo ultralimpio durante más de 15 minutos
_ Use alcohol Limpie la marca del tubo EP en la mesa 2. Tratamiento de homogeneización 1) Tome una cierta cantidad de suspensión de esporas purificada, centrifugue a 12000 rpm durante 5 minutos, deseche el sobrenadante
_ O use un homogeneizador para homogeneizar y suspender. Sin centrifugar, agregue directamente 0,5 ml de reactivo Trizol en hielo para homogeneizar completamente la suspensión. El volumen de la muestra generalmente no debe exceder el 10% del volumen de Trizol. Luego agregue 0,5 ml de Trizol para enjuagar el homogeneizador y transferirlo a un EP de 1,5 ml. tubo
_ Agregue Trizol directamente a la suspensión para lisar las células, agregue 1 ml de Trizol. Use un muestreador para pipetear varias veces (centrifugue para tomar las células, agregue cada 5-10 × 106 células animales, vegetales y de levadura. o cada 107 células bacterianas. 1 ml de Trizol. No lave las células antes de agregar Trizol para evitar la degradación del ARNm. Algunas células de levadura y bacterias pueden requerir un tratamiento con homogeneizador. 2) 1 ml de reactivo Trizol, agitar y mezclar. 15-30°C durante 5 min. Los complejos de proteína y ácido nucleico se separan completamente. 4) Paso opcional: Centrifugar a 12 000 rpm durante 10 minutos a 4°C y tomar el sobrenadante.
_绻分下 brecha salarial suspiro silla de montar vivir ⒅ hacer ⒍ ciempiés cavidad tom ∪ suan ⒅ tecnecio ginseng 夤诓 valor de salvado 狋camisa zhouna コ ＠ 蔄 mu Mei dejar caer un cierto amor 簇 maldad ㄏ ir a la pasteleríaぁ⒍嗵奇⒏叻埿_NA, el sobrenadante contiene ARN. Al procesar muestras de tejido adiposo, la capa superior contiene una gran cantidad de aceite y debe eliminarse. Tome la solución homogeneizada transparente para el siguiente paso. 5) Añadir 0,2ml de cloroformo por cada 1ml de Trizol utilizado, tapar el tubo, agitar en un agitador vortex durante 15s y dejarlo a temperatura ambiente durante 3min. Si no es posible mezclar con vórtice, se puede utilizar la inversión manual y mezclar durante 2 minutos. 6) 4 ℃ 12 000 rpm, centrifugar durante 10-15 minutos. La muestra se dividirá en tres capas: fase orgánica roja, capa intermedia y fase acuosa superior incolora. Coloque la fase acuosa (aproximadamente 600 ul). aprox. 60) de reactivo Trizol en un tubo nuevo. (Si desea separar proteínas y ADN, puede conservar la fase orgánica amarilla) 7) Agregue un volumen igual (500 ul) de alcohol isopropílico a la solución de fase acuosa obtenida, mezcle invirtiéndola hacia arriba y hacia abajo y colóquela en -20°C durante 20-30 minutos.
_Durante la extracción de NA, una gran cantidad de proteínas y otros contaminantes se precipitan fácilmente, lo que hace que el ARN no sea visible durante la detección por electroforesis. Puede reducir la contaminación siguiendo los pasos a continuación: Agregue 1/2 volumen de alcohol isopropílico y 1/2 volumen de ayuda de precipitación de ARN al sobrenadante y luego realice las siguientes operaciones. ) 8) Centrifugar a 12.000 rpm a 4°C durante 10 minutos y retirar el sobrenadante.
Los precipitados de NA suelen ser invisibles y se forman precipitados gelatinosos en los lados y el fondo del tubo después de la centrifugación. ) 9) Añadir 1 ml de etanol 75 (preparado a partir de agua tratada con DEPC) para lavar el precipitado. Después de agregar, golpee el tubo para que el precipitado de ARN flote tanto como sea posible. Agregue al menos 1 ml de etanol por cada 1 ml de Trizol utilizado. A veces, para evitar que el ARN se elimine por lavado, se puede omitir este paso. Después del lavado, se puede secar o hornear con etanol, pero no debe estar demasiado seco, de lo contrario no será fácil de disolver. 10) Centrifugar a 12.000 rpm durante 5 minutos a 4°C, desechar el sobrenadante centrifugar breve y rápidamente, desechar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y tener cuidado de no desechar el precipitado; 11) Déjelo secar a temperatura ambiente (no lo seque demasiado, será difícil disolver el ARN una vez que esté completamente seco y tardará entre 2 y 3 minutos en secarse). Agregue una cantidad adecuada de agua DEPC (se pueden agregar 30-100 ul de agua según las necesidades experimentales) o 0,5 SDS y pipetee varias veces para disolver completamente el ARN. Mantener caliente a 50 grados durante 1 hora. Si se utiliza ARN para la reacción de digestión enzimática, no utilice solución SDS. El ARN también se puede preparar con formamida 100% desionizada. Disolver y almacenar a -70°C.
Se puede almacenar en alícuotas para evitar la contaminación. 12) Tome 1 ul de tampón y realice una electroforesis para detectar la integridad del ARN, diluirlo hasta un múltiplo determinado y medir la pureza y la concentración con un espectrofotómetro.