heidolfo
La sulfametazina (SM) es una de las sulfamidas más utilizadas en la producción ganadera.
Se utiliza ampliamente en el tratamiento y prevención de enfermedades del ganado y las aves de corral. El consumo de tejidos animales que contienen sulfametazina puede provocar reacciones alérgicas en el cuerpo y destruir el equilibrio de la flora normal del cuerpo, lo que provoca que las bacterias patógenas desarrollen resistencia a los medicamentos. En mi país, la UE y la FAO/OMS estipulan que el límite máximo de residuos de SM en tejidos animales es de 100 ug/kg. Las sulfamidas utilizadas en la cría de animales
entran en el ambiente externo y pueden filtrarse a las aguas subterráneas o contaminar los estanques cercanos con aguas residuales
o escorrentías superficiales.
Puede ser tóxicos para organismos no objetivo en el medio acuático o se acumulan en sus cuerpos, causando contaminación ambiental [2]. También han suscitado preocupación los residuos resultantes del fármaco en los productos acuáticos.
En animales, la sulfametazina se metaboliza principalmente por la acetilasa
para formar sulfametazina N-acetilada (N-ACE—
SM )estado L3]. En el cuerpo humano, N-ACE-SM puede transformarse de forma reversible en el prototipo de fármaco, teniendo así actividad farmacológica. Por lo tanto, también es necesaria la determinación del residuo de N-ACE-SM
. Japón estipula que los marcadores de residuos de sulfametazina son el prototipo de sulfametazina y N-ACE—
SMz L6J. Este artículo estableció un método de cromatografía líquida de alta resolución para la determinación del prototipo de sulfametazina y de los residuos de sulfametazina acetilada.
l Materiales y métodos
1.1 Materiales de prueba
1.1.1 Sulfametazina estándar, cristal blanco, pureza >99, Estados Unidos Sigma Company; ,
Cristal blanco, sintetizado por nuestro laboratorio.
1.1.2 Reactivos principales: acetonitrilo, cromatográficamente puro, Fisher Company; vinagre glacial
Ácido: grado analítico, Beijing Chemical Reagent Company, n-hexano, sulfato de sodio anhidro; >
p>
Y n-propanol: ambos de grado analítico, Beijing Chemical Factory.
1.1.3 Instrumentos y equipos principales: cromatógrafo líquido de alta resolución: controlador del sistema SCL-10AVP, dispositivo desgasificador DGU-12A, detector de matriz de diodos SPDM10AVP, Bomba LC-10ATVP,
Estación de trabajo Class-VP (Compañía Japonesa Shimadzu). Ajuste de velocidad multiuso
Oscilador: tipo HY-4, Changzhou Tonghua Electric Co., Ltd. Homogeneizador de tejidos
Máquina despulpadora: Nissei AM-6, Japanese Ace Company. Evaporador rotativo:
Tipo Laborota 4003, Heidolph Company, Alemania. Centrífuga:
LD4-2A, Fábrica de Centrífugas Médicas de Beijing. Balanza electrónica: 0,01 mg,
Compañía Sartorius. Micropipeta: Beijing Qingyun Aviation Instrument Co., Ltd. Agitador magnético: Tipo 7 8-1, Fábrica de Electrodomésticos Zhejiang Yueqing Lecheng. La bomba de vacío de diafragma (GM-0.33) y el filtro de disolvente son productos de Tianjin Tengda Filtration Device Factory. Columna SPE: Sep-Pak Vac
Columna de alúmina básica de 12 cc (2 g), Waters Company de Estados Unidos.
1.2 Método de ensayo
1.2.1 Condiciones cromatográficas Columna: columna de cromatografía líquida de fase inversa C e,
Inertsil ODS-3( 4,6 mm×250 mm , tamaño de partícula 5 m); flujo
Fase móvil: agua-acetonitrilo-ácido acético (76:24:0,05, V/V/V); ; volumen de inyección: 50 ttL; caudal: 1 ml/min.
1.2.2 Preparación de la solución estándar Pesar con precisión 0,010 0 g cada uno de SM y N-
ACE-SMz, disolverlo en acetonitrilo y ajustar el volumen a 100
p>
mL, configurado en dos soluciones madre estándar de 100 ttg/mL, almacenado a -20 ℃
protegido de la luz. Luego, la solución madre estándar se diluye con acetonitrilo para preparar una solución de trabajo estándar con una concentración de 10 µg/ml y se almacena en la oscuridad a -20°C.
1.2.3 La curva estándar se dibuja el día de la medición. Utilizar la fase móvil para diluir la solución de trabajo estándar de SM y N-ACE-SM para preparar una concentración de 0,01, inyectar 50 L de. cada solución estándar mixta de 0,02, 0,05, 0,10, 0,50, 1,00 y 2,50
t*g/mL para análisis HPLC
Mida e integre el área del pico. Inyecte cada concentración 5 veces, tome el valor promedio,
luego use la concentración como abscisa y el área del pico como ordenada para dibujar las curvas estándar de los dos compuestos anteriores.
Encuentre la curva de regresión y el número del coeficiente de correlación.
1.2.4 Pretratamiento de la muestra
1.2.4.1 Extracción y purificación: Pelar el músculo de esturión e incubar a 15 000
r /Lluvia homogeneizar durante 3 minutos, pesar con precisión 2,00 g de homogeneizado de tejido muscular
, añadir 25 ml de acetonitrilo, 4 g de sulfato de sodio anhidro y agitar a velocidad media durante 20 minutos
, centrifugar a 3 000 r /lluvia por 5 lluvias. Poner el sobrenadante en un embudo de decantación de 100 ml que contenga 30 ml
n-hexano, agitar durante 1 minuto, dejar reposar durante 20
lluvia y recoger la capa inferior. El residuo separado se extrajo una vez con 25 ml de acetonitrilo, se agitó durante 20 minutos y se centrifugó a 3000 r/lluvia durante 5 minutos.
Se destila y el residuo se disuelve en 5 ml de acetonitrilo-agua (95:5, V/V).
1.2.4.2 Extracción: Utilice 15 mL de acetonitrilo-agua (95:5,
V/V) para equilibrar la alcalinidad del Sep-Pak Vac 12cc (2g) con antelación Alúmina columna,
luego cargue la muestra, lave con 5 ml de acetonitrilo-agua (95:5, V/V), no recolecte luego use 5 ml de acetonitrilo-agua (95:5, V/V); ) 75:25, V/V) para eluir, recoger
el eluato, soplar nitrógeno hasta casi secar y ajustar el volumen del residuo a 2,0
ml con fase móvil. y preparar. El líquido de la muestra se detectó mediante cromatografía líquida de alta resolución.
1.2.5 Para la determinación de la tasa de recuperación, se configuraron 3 niveles de adición de tejido de 20, 100 y 2 000 t*g/kg. También se configuró un control en blanco en cada nivel. arriba 5 hileras planas
. Pesar 2,00 g de tejido muscular homogeneizado respectivamente y añadir un cierto volumen de solución de trabajo estándar para que las concentraciones del fármaco en el tejido muscular sean 20, 100 y 2 000 t* respectivamente. durante 1 minuto, dejar reposar durante 10 minutos, procesar según el método de pretratamiento de la muestra y luego realizar el análisis HPLC. Calcule la concentración y la tasa de recuperación de cada componente en función de su área de pico.
1.2.6 Determinación del límite de detección Se pesaron con precisión 10 muestras en blanco de músculo de esturión, 2,00 g de cada músculo en blanco y se procesaron de acuerdo con el método de pretratamiento de la muestra.
Mida la línea de base valor de ruido y calcularlo en función de la relación señal-ruido de 3 para obtener el SM en el tejido de la carne del músculo del esturión. Y el límite de detección del método de ensayo N-ACE-SM2.
1.2.7 Determinación de la precisión Dentro de 3 días, pesar con precisión el homogeneizado todos los días
2,00 g de cada tejido, 3 paralelos de cada concentración, agregar por separado Usar un cierto volumen de estándar solución para hacer que la concentración de fármacos SM y N-ACE-SM en el tejido sea 20, 100, 2 000 t, g/kg y agite durante 1 lluvia, déjelo reposar durante 10 lluvias y luego proceda de acuerdo con el método de pretratamiento de la muestra. Tome 5 muestras para cada concentración en El y repita la inyección y medición de cada muestra 5 veces. Las 3 concentraciones agregadas anteriores se repiten 3 veces en El. Encuentre el producto de superficie máxima de cada componente y calcule el error promedio y estándar de las tasas de recuperación de los dos fármacos dentro y entre El.
2 Resultados
2.1 Curva estándar
Tome las concentraciones de sulfametazina y N-acetilo preparadas anteriormente
La solución de trabajo estándar mixta de La sulfametazina se midió en condiciones cromatográficas seleccionadas
a una concentración de 0,01 a 2,0 p. Dentro del rango de g/mI,
el área del pico cromatográfico está relacionada linealmente con la concentración. Como se muestra en la Tabla 1, los cromatogramas de estándares y muestras se muestran en la Figura 1.
Tabla 1 SM:, N'-ACE-SM: ecuaciones de regresión de curvas estándar y coeficientes de correlación
Tabla 1 Ecuaciones de regresión de curvas estándar y
coeficientes correlativos de SM 2 y N'-ACE-SM2
2.2 Límite de detección
Según los valores de ruido basales de 10 tejidos en blanco, encuentre el valor promedio
El límite de detección se calculó como 3 veces el ruido promedio, y los límites de detección de SM, N-ACE-SM2 en el tejido muscular fueron ambos de 10,0 ttg/kg.
2.3 Tasa de recuperación y precisión de la adición
A 3 concentraciones de 20, 100 y 2 000 ttg/kg (baja, media y alta)
Nivel de adición, la prueba de adición y recuperación se realizó en muestras de músculo de esturión. Los resultados se muestran en la Tabla 2 y la Tabla 3.
Tabla 2 Recuperación de SM: y N4_ACE-SM: en tejido muscular de esturión
Tasa de recuperación adicional (n-5)
Tabla 2 Recuperación de SM2 y N4_ACE·SM2
de músculos fortificados
3 Discusión
3.1 Extracción de muestras
Acerca de la sulfametina en tejido muscular Para el método de extracción de pirimidina y sulfonamida N-acetilada
dimetilpirimidina, los informes existentes utilizan principalmente diclorometano
acetonitrilo o ácido metafosfórico-metanol (2: 1, V/V)[ como disolvente de extracción. Cuando se extrae con cloruro de metileno, el tejido flota en la superficie del disolvente de extracción, lo que dificulta su vertido. Cuando se utiliza ácido metafosfórico-metanol como disolvente de extracción, contiene una gran cantidad de agua, lo que reduce el tiempo de destilación a presión. Consumo y laborioso; el acetato de etilo tiene la mayor eficiencia de extracción, pero también extrae la mayoría de las sustancias endógenas del tejido.
La purificación es difícil y el método de purificación necesita más investigación. Si se utiliza acetonitrilo como disolvente de extracción, la eficiencia de extracción es baja, pero al aumentar la cantidad de disolvente de extracción, se puede obtener una tasa de recuperación satisfactoria. Además, al extraer con acetonitrilo, la eficiencia de extracción es menor.
También hay menos impurezas. Después de ensayos repetidos, el analito objetivo se puede extraer con 25 ml de acetonitrilo y extraer 2 veces.
La sal favorecerá la precipitación de solutos y mejorará el efecto de extracción de los disolventes orgánicos
. En este experimento, se agregó NazSO anhidro al solvente de extracción para mejorar la eficiencia de extracción de la sulfametazina y la sulfametazina N-acetilada. Cuando se agregó NaSO cuando alcanza los 4 g, la tasa de recuperación ya no aumenta.
Por tanto, la cantidad de sulfato sódico anhidro añadido es de 4 g.
3.2 Purificación de la muestra
La purificación de la muestra es un paso clave en el paso de pretratamiento de la muestra.
La elección del tipo de columna SPE es particularmente importante y está directamente relacionada con. Devuelve
rendimiento al método. La columna SPE reportada en la literatura para la purificación es C. . Columna [3], la columna de alúmina alcalina utilizada en este método es una columna de fase normal. El disolvente de elución tiene un coeficiente de viscosidad pequeño y se seca rápidamente en estado natural.
3.3 Detección
Para la detección de sulfas, los informes bibliográficos incluyen detectores ultravioleta,
fotodetectores fluorescentes y detectores electroquímicos. Los electrodos de los detectores electroquímicos deben permanecer estables durante mucho tiempo y las impurezas de la muestra pueden contaminar fácilmente los electrodos. Los detectores de fluorescencia
son más sensibles y selectivos que los detectores UV. SM
El producto generado después de la derivatización con fluorescamina es fluorescente, pero N-
N-ACE-SM no se puede derivatizar con fluorescamina, lo que limita la aplicación del detector de fluorescencia
. El detector UV es actualmente el detector más utilizado para medir las sulfonamidas. Se puede medir directamente sin derivatización y es sencillo y rápido. Nosotros
Utilizamos un detector de matriz de diodos para detectar y seleccionamos la longitud de onda de absorción máxima de los dos espectros de fármacos
como longitud de onda de medición. El espectro se muestra en la Figura 2.
3.4 Tasa de recuperación y límite de detección
Bajo esta condición de prueba, el tejido muscular del esturión se probó a 20, 100,
2 000 ttg/kg dentro del En un rango de concentración agregado, los límites de detección de sulfametazina y sulfametazina N-acetilada son ambos de 10,0 "g/kg. Ho—
rie et al. L7 informa que el límite de detección del método utilizado para determinar los dos anteriores drogas en el músculo es de 20,0 gg/kg. El límite de detección de este método es inferior al valor informado en la literatura. La tasa de recuperación es cercana a eso, pero el funcionamiento de este método es relativamente simple. 3.5 Precauciones de operación
Las sulfonamidas no son adecuadas para su uso en altas temperaturas, luz directa, exposición al aire y otros ambientes
Condiciones en las que habrá degradación parcial y pérdida por oxidación, por lo que durante la muestra Durante el proceso de operación de extracción y purificación, es necesario operar en un lugar oscuro y a temperatura ambiente inferior a 25°C
tanto como sea posible. Los utensilios también deben estar lo más dorados posible. posible; la solución estándar
y la solución de muestra deben almacenarse en condiciones de refrigeración y protegidas de la luz. La solución de muestra también debe analizarse lo antes posible
Los resultados de esta prueba; indique, la solución estándar de 100 ttg/mL se puede almacenar durante 6 meses a
-20 ℃ y en condiciones de oscuridad
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