¿Cuál es el principio y método de funcionamiento de la tecnología RACE?

Hola cartel: El principio y el funcionamiento de la tecnología RACE Con ​​el desarrollo continuo de la biotecnología en los últimos años, han surgido muchos métodos y medios para clonar nuevos genes, como la tecnología de clonación de mapas, la tecnología de etiquetas de transposones. ARNm tecnología de visualización diferencial, tecnología de sustracción de dos genomas y tecnología de detección de bibliotecas de ADNc, etc. Sin embargo, los métodos mencionados anteriormente se caracterizan por largos ciclos experimentales, pasos técnicos engorrosos y una gran carga de trabajo. La amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE) es un método eficaz basado en la PCR para amplificar rápidamente los extremos 5' y 3' del ADNc a partir de transcritos de baja abundancia. Es sencillo, rápido y económico, y otras ventajas han atraído cada vez más atención. . La tecnología RACE clásica es una tecnología inventada por Frohman et al (1988). Utiliza principalmente tecnología RT-PCR para obtener los extremos 5' y 3' completos del ADNc a partir de secuencias parciales de ADNc conocidas, incluida la PCR de un solo lado y la PCR anclada. . Esta tecnología se ha desarrollado y mejorado continuamente desde que fue propuesta y ha superado las deficiencias de los primeros pasos técnicos, el largo tiempo y la poca especificidad (Frohman et al., 1995: Schaefer, 1995: Chen, 1998: Bespalova et al., 1998: Matz et al. 11999). La mejora de la tecnología RACE tradicional es principalmente la mejora del diseño de cebadores y la tecnología RT-PCR: una de las mejoras es utilizar un cebador de acoplamiento de bloqueo para sintetizar la primera hebra de ADNc, es decir, introducir dos hebras de ADNc en el extremo 3'. extremo del cebador oligo (dT). Un nucleótido degenerado 5'-Oligo (dT) 16-30MN-3', M=A/G/C; de la cola de poli (A) El punto de partida, eliminando así el impacto de la combinación de oligo (dT) y cualquier parte de la cola de poli (A) al sintetizar la primera hebra de ADNc; la segunda mejora es utilizar poli (C); al agregar una cola al extremo 5') en lugar de poli(A); la tercera mejora es usar la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina RNasa H-moloney (MMLV) o seleccionar ADN polimerasa termófila que puede ser eficaz a altas temperaturas (60). °C -70°C). Transcripción inversa de ARNm, eliminando así el impacto de la estructura secundaria del ARNm en la transcripción inversa causado por el alto contenido de CC en el extremo 5'. La cuarta mejora es utilizar PCR de inicio en caliente (hot start); iniciar PCR) tecnología y aterrizar PCR (touch down PCR) para mejorar la especificidad de la reacción de PCR. Para obtener más información técnica sobre pruebas de calidad, pruebas analíticas, mediciones químicas y materiales de referencia, consulte Materiales estándar nacionales y materiales estándar de materiales de construcción. plist_1/plist_1_28_0_1.html A medida que la tecnología RACE se vuelve cada vez más perfecta, actualmente se lanzan productos comerciales de tecnología RACE, como la tecnología MarathoTM de CLONTECH y la tecnología SMARTTM RACE Short. La razón es que la reacción de transcripción inversa de la tecnología MarathonTM a menudo no puede alcanzar los 5. ' extremo del ARNm Por lo tanto, se cree que se debe preferir el kit SMARTTM RACE para la reacción RACE. El siguiente es un breve ejemplo del kit SMARTTM RACE que es actualmente el más utilizado en China. Proceso de operación de la tecnología RACE El principio de SMARTTM 3'-RACE utiliza la cola poli (A) en el extremo 3' del ARNm como sitio de unión del cebador para conectar el Oligo (cebador adaptador universal de secuencia de oligonucleótido SMART) 30MN. Se utiliza como cebador de bloqueo para transcribir de forma inversa y sintetizar ADNc de primera cadena estándar. Luego se utiliza un cebador específico de gen GSP1 (cebador específico de gen, GSP) como cebador aguas arriba y un cebador universal que contiene UPM (cebador universal, UPM). Se utiliza una secuencia enlazadora parcial. Como cebador aguas abajo, utilice la primera hebra de ADNc como plantilla para realizar ciclos de PCR para amplificar el fragmento de ADN en el extremo 3' del gen diana.