Principios y pasos del experimento con chips
Principio experimental del chip
El complejo proteína-ADN se fija en un estado de célula viva y se corta aleatoriamente en pequeños fragmentos de cromatina dentro de un cierto rango de longitud, y luego, mediante métodos inmunológicos, este complejo se precipitado para enriquecer específicamente los fragmentos de ADN unidos por la proteína diana. Mediante la purificación y detección de los fragmentos diana, se puede obtener información sobre la interacción entre la proteína y el ADN.
Los pasos específicos del experimento del chip son los siguientes:
Día 1:
(1) Reticulación de formaldehído y alteración ultrasónica de las células.
1. Sacar las células en un plato de 10cm (plato de 10cm) y añadir 243ul de formaldehído al 37% para que la concentración final de formaldehído sea del 1%. (La cantidad máxima de medio de cultivo es 9 ml)
2. Incubar a 37 ℃ durante 10 minutos.
3. Terminar la reticulación: añadir glicina hasta una concentración final de ?0,125M?. 450ul?2,5M?Glicina en un plato. Después de mezclar, déjelo a temperatura ambiente durante 5 minutos.
4. Aspirar el medio de cultivo y lavar las células 2 veces con PBS helado.
5. Utilice un raspador de células para recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 ml (el PBS es de 5 ml, 3 ml y 3 ml en orden). Después del preenfriamiento, recoger las células a 2000 rpm durante 5 minutos.
6. Desechar el sobrenadante. Según el volumen de la célula, agregue SDS Lysis Buffer. Haga que la concentración final de células contenga 2 × 106 células por 200 ul. De esta forma, cada solución de 100ul contiene 1×106 células. Luego agregue el complejo inhibidor de proteasa. Supongamos que la placa MCF7 está llena de 5 × 106 celdas. Esta vez las células han crecido aproximadamente un 80%. Eso es ?4 × 106? Por lo tanto, agregue 400 ul de tampón de lisis SDS a cada tubo. Mezcle los 2 tubos para obtener 800 ul.
7. Trituración ultrasónica: VCX750, 25% de potencia, impacto 4.5S, brecha 9S. ***14 veces. Por supuesto, sería fácil si el laboratorio tuviera un artefacto como Bioruptor.
(2). Eliminación de impurezas y cultivo de anticuerpos.
8. Después de la trituración ultrasónica, centrifugar a 10.000 g a 4 grados durante 10 minutos. Retire el material insoluble. Reserve 300 ul para experimentos y almacene el resto a -80 °C. Entre 300 ul, 100 ul añadidos con anticuerpo sirven como grupo experimental; 100 ul añadidos sin anticuerpo sirven como grupo de control, 100 ul añadidos con 4 ul de NaCl 5 M (la concentración final de NaCl es 0,2 M), tratar a 65 °C durante 3 horas para resolver; reticulación, ejecutar electroforesis y detectar el efecto de la interrupción ultrasónica.
9. Agregue 900 ul de tampón de dilución ChIP y 20 ul de 50 × PIC a 100 ul del producto ultrasónico roto. Luego agregue 60 ul de proteína A de agarosa/ADN de esperma de salmón cada uno. Invertir y mezclar a 4°C durante 1 hora.
10. Pasada 1 hora, dejar reposar 10 minutos a 4 grados centígrados para que precipite y centrifugar a 700 rpm durante 1 minuto.
11. Tomar el sobrenadante. Mantenga "20ul" de cada uno como "entrada". Agregue ?1ul? de anticuerpo a un tubo y no agregue ningún anticuerpo al otro tubo. Déle la vuelta a 4°C durante la noche.
(3) Pruebe el efecto de la fragmentación ultrasónica.
Tomar 100ul del producto después del triturado ultrasónico, añadir 4ul de NaCl 5M y tratarlo a 65°C durante 2h para disolver el entrecruzamiento. Separar la mitad y extraer con fenol/cloroformo. La electroforesis detecta los efectos del ultrasonido.
Al día siguiente:
(1) Precipitación y limpieza de complejos inmunes.
12. Después de incubar durante la noche, agregue 60 ul de proteína A de agarosa/ADN de esperma de salmón a cada tubo. Inversión de 4° durante 2 horas.
13. Después de dejar a 4°C durante 10 minutos, centrifugar a 700 rpm durante 1 minuto. Retire el sobrenadante.
14. Lavar el complejo precipitado con las siguientes soluciones en secuencia.
Pasos de limpieza: agregar solución, invertir a 4°C durante 10 min, dejar reposar a 4°C durante 10 min para precipitar, centrifugar a 700 rpm durante 1 min y eliminar el sobrenadante.
Solución de lavado:?a.?baja?en?sal?lavado?búfer----un?lavado
b.?alta?sal?lavado?búfer----- un?lavado
c.?LiCl?wash?buffer------un?lavado
d.?TE?buffer------dos?lavado
15. Después de la limpieza, comience la elución. La fórmula del eluyente: ?100ul?10?%?SDS, ?100ul?1M?NaHCO3?, ?800ul?ddH2O?, ***?1ml?. Añadir 250 ul de tampón de elución a cada tubo, invertir a temperatura ambiente durante 15 minutos, dejar reposar, centrifugar y recoger el sobrenadante. Repita el ciclo de lavado. El eluyente final es de 500ul por tubo.
16. Resolver el entrecruzamiento: Añadir 20ul de NaCl 5M a cada tubo (la concentración final de NaCl es 0,2M). Mezclar bien y desreticular a 65°C durante la noche.
El tercer día:
(1). ¿Recuperación de muestras de ADN?
17. Una vez completado el entrecruzamiento, agregue ?1ul?RNaseA? a cada tubo (MBI), incubar a 37°C durante 1 hora.
18. Agregue ?10ul?0.5M?EDTA?,?20ul?1M?Tris.HCl?(?PH?6.5),?2ul?10mg/ml?Protease?K a cada tubo. Tratamiento a 45°C durante 2 horas.
19. Recuperación de fragmentos de ADN—kit de recuperación de gel omega. La muestra final se disolvió en ?100ul?ddH2O?.
(2) Análisis por PCR
Resumen de la tecnología ChIP
(1) Acerca de las células
El estado de crecimiento de las células debe ser bueno. ?Debido a que el estado de crecimiento de las células afecta directamente a la red reguladora de la expresión genética dentro de las células, también es muy probable que afecte la combinación del TF que está estudiando y su promotor objetivo. Generalmente, es mejor que las células crezcan entre un 75% y un 80%.
(2) Acerca de los anticuerpos
¡Los anticuerpos son uno de los factores fatales para el éxito o el fracaso de los experimentos! Deben ser anticuerpos de nivel IP. Además, si las condiciones económicas lo permiten, Intente comprarlos de los principales fabricantes de anticuerpos. No se recomiendan los anticuerpos domésticos ni los anticuerpos de Santa Cruz, incluso si son de grado IP.
La elección de anticuerpos monoclonales y policlonales también requiere una cuidadosa consideración. ?Ambos anticuerpos tienen pros y contras. ?El anticuerpo monoclonal tiene una fuerte especificidad y un fondo bajo. ?Pero el anticuerpo monoclonal tiene una debilidad fatal, es decir, tiene un único sitio de reconocimiento durante el proceso de ?entrecruzamiento del formaldehído ChIP, es muy probable que este sitio esté unido por otras proteínas o ácidos nucleicos y quede bloqueado. , lo que lleva a que el anticuerpo monoclonal no pueda reconocerla. ?Aunque los anticuerpos policlonales no tienen este problema, ?los anticuerpos policlonales tienen poca especificidad y el fondo puede ser alto.
En general, si no estás completamente seguro (el sitio de reconocimiento del anticuerpo monoclonal está lejos de la región donde la proteína diana se une al ácido nucleico), es más seguro elegir un anticuerpo policlonal.
(3) Acerca de la reticulación y la disrupción ultrasónica
De hecho, esta es una parte difícil de comprender en el experimento ChIP. El grado de entrecruzamiento afectará el efecto de la fragmentación ultrasónica. Cuanto mayor sea el grado de entrecruzamiento, es menos probable que la fragmentación ultrasónica rompa el genoma en pequeños fragmentos.
El entrecruzamiento es insuficiente y solo una parte de la proteína objetivo se combina con su Promotor. La cantidad de Promotor obtenida por enriquecimiento no es alta y el experimento es falsamente negativo. ?El entrecruzamiento es demasiado suficiente y?demasiadas proteínas están unidas al genoma, lo que obstaculiza la fragmentación ultrasónica. También se agregará un fondo.
Como regla general, las condiciones de entrecruzamiento dependen del tipo de célula. ?Las diferentes líneas celulares tienen diferentes condiciones de reticulación. Por ejemplo: las condiciones de reticulación de NIH-3T3 son 15 minutos a temperatura ambiente (25 grados Celsius) y una concentración de formaldehído del 1%, mientras que otras líneas celulares pueden ser completamente diferentes. En cuanto a las condiciones para la trituración ultrasónica, las máquinas son diferentes y las condiciones también son diferentes.
Por supuesto, si tiene un artefacto como un bioruptor, la fragmentación ultrasónica será pan comido para usted. Generalmente, el tamaño de fragmento ideal obtenido mediante sonicación es de entre 200 pb y 1000 pb. Pero el rango de 200 pb-2000 pb también es aceptable.
(4) Acerca del funcionamiento
Esperamos mantener la temperatura lo más baja posible (?4? grados). Al reposar, primero puedes colocarlo a 4°C por un tiempo, esperar a que se asiente naturalmente y luego centrifugar a velocidad ultrabaja (500 rpm, etc.) para permitir que se asiente por completo. Aunque las instrucciones dicen que hay varios lugares donde puedes hacer una pausa durante el experimento ChIP, todavía espero que puedas completarlo continuamente hasta que salgan los resultados de la PCR. Trate de evitar factores de influencia impredecibles en el experimento.
(5) Acerca del descruzamiento
Aunque las instrucciones dicen que 4 horas son suficientes, aún espero que puedas descruzarlo durante la noche. Porque en un entorno así, el ADN no se degradará y los entrecruzamientos se descompondrán más completamente durante la noche. No olvides sellar el tubo EP con parafilm.
(6) Con respecto a la recuperación de fragmentos de ADN
Cabe señalar que las muestras de SDS en las muestras son relativamente altas y la recuperación de los kits de recuperación de productos de PCR ordinarios es muy difícil. Es posible que se mezcle SDS con la muestra final, lo que afectará los resultados experimentales de la PCR. Pequeño consejo: antes de pasar por la columna, agregue una cierta cantidad de alcohol isopropílico a la muestra para eliminar eficazmente la precipitación de SDS.