Buscamos opiniones sobre los detalles de la prueba desplegable de GST

El ensayo desplegable GST es una tecnología de detección in vitro eficaz para verificar el sistema de dos híbridos de levadura y ha sido favorecido por cada vez más académicos en los últimos años. El principio básico es fijar por afinidad la proteína de fusión proteína objetivo-GST en la resina de afinidad por glutatión, sirviendo como una "proteína cebo" como soporte para la afinidad con la proteína objetivo. La solución de proteína objetivo pasa a través de la columna y la "proteína de captura" que interactúa (proteína objetivo) se puede capturar de la columna. El conjugado se eluye y se analiza mediante electroforesis SDS-PAGE para confirmar la interacción entre las dos proteínas o detectar la correspondiente. Proteínas objetivo, "proteínas cebo" y "proteínas capturadoras". El método es simple y fácil de implementar. GST: Clonación molecular de glutatión S-transferasa, tercera edición, introducción detallada. Es fácil entender que la tecnología de precipitación de proteínas de fusión GST utiliza la afinidad de GST por las perlas acopladas a glutatión para purificar proteínas que interactúan a partir de una solución de proteínas que no interactúan. Las proteínas sonda fusionadas con GST se expresan y purifican a partir de bacterias, y en paralelo se preparan lisados ​​celulares (que pueden estar marcados con 35S o sin etiquetar). Luego se mezclaron e incubaron la proteína sonda fusionada con GST y el lisado celular en presencia de perlas de agarosa Gu-Gu-Gan-Fu para unir la proteína. La proteína de la sonda de fusión GST y cualquier molécula unida se recogen mediante centrifugación y la mezcla resultante se lava, se eluye con un exceso de gel viscoso libre o se hierve directamente en tampón de carga SDS-PAGE. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y se analizaron mediante transferencia Western, autorradiografía y tinción de proteínas. La técnica de sedimentación GST es particularmente útil para detectar interacciones de proteínas en solución, que pueden no detectarse en los análisis de membrana. Los experimentos de sedimentación de GST generalmente tienen dos aplicaciones: identificar nuevas interacciones entre proteínas de fusión (o sonda) y proteínas desconocidas (o diana) (Kaelin et al. 1991, grlinick y Chao 1996), y confirmar que la proteína sonda y una proteína conocida. proteínas (ver Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunter et al. 65438+ El diseño y la implementación de estos dos experimentos son diferentes Propósito: Detectar interacciones proteína-proteína in vitro). interacción entre dos proteínas conocidas, o para detectar proteínas desconocidas que interactúan con proteínas conocidas. Principio experimental: la proteína sonda se fusiona con GST (transferencia de glutatión S) mediante tecnología recombinante, y la proteína de fusión pasa a través de ella con afinidad a GTH (. glutatión) inmovilizado en el soporte, por lo tanto, cuando la proteína que interactúa con la proteína de fusión se pasa a través de la columna de cromatografía o se mezcla con el complejo sólido, se puede adsorber y separar usando reactivos: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4, Triton-100. , IPTG (Merck), PMSF (Amosco), Koctair (Merck 53965438+) Glutatión inmovilizado (Pierce 15160) Procedimientos experimentales: Materiales y reactivos: proteína procariótica fusionada con GST, proteína de células lisadas o extracto de proteína de tejido

Lisado de proteína celular, eluyente: PBS y PBS+1% Triton-100 PBS (1L) NaCl: 8g KCl: 0,2g na 2 hpo 4: 1,44g kh2po 4: 0,24g Añadir 800ml de agua destilada, ajustar el valor del pH. la solución a 7,24 g se almacena a 4 °C para su uso posterior. PMSF (fluoruro de bencilsulfonilo) PM: 174,19 la concentración de trabajo es 0,1 -1 mM, se utiliza 1 mM, la concentración de almacenamiento es 100 mM, 0,174 g de PMSF se disuelve en 65438+. Almacenar a -20 ℃ o 4 ℃ (el siguiente proceso solo se usa para estudiar la interacción entre la proteína A procariótica conocida y la proteína B sobreexpresada en eucariotas) Función) 1: Obtener la proteína de fusión procariótica A 1.1: Mezclar la proteína codificante recombinante A y GST. en BL21 (DE3) Cepa 1.2: Elija un único clon y colóquelo en un tubo de ensayo de 10 ml que contenga 5 ml de LB (+100 ug/ml Amp), 37. Cultivo durante la noche a ℃ 1,3: Transfiera el medio de cultivo a 100 ug/ml Amp que contenga 500 ml de LB (+ 100ug/mlAmperio).

Cultivo a 225 rpm hasta OD600≈1,0-1,5, añadir la concentración adecuada de IPTG, incubar a la temperatura adecuada durante el tiempo adecuado (las condiciones de inducción deben ajustarse según las diferentes proteínas) 6000 g, 10 minutos, centrifugar a 4 °C para recoger las células. eliminar el sobrenadante. Se eliminó el líquido transparente y las células se colocaron a -20°C. Coloque inmediatamente en hielo, agregue 10-20 ml de solución de lisis bacteriana (PBS+1% Triton-10PMSF) por 500 ml de medio de cultivo, sople y mezcle uniformemente durante 1,5: pausa ultrasónica en hielo, comience durante 2 segundos, detenga durante 9 segundos, un total de 40 a 60 minutos. Hasta que el lisado se enfríe por completo, 1,6: 11000 rpm, 15 minutos, centrifugar el sobrenadante a 4°C y almacenar a -80°C para su uso posterior. 2. Obtener la proteína de fusión eucariótica b

2.1: clonar la secuencia de bases que codifica la proteína B en un vector de expresión eucariótica que codifica la proteína etiqueta (como HA o myc), 3: usar XQ después de 48 horas para transfectar células, Congele y descongele una cantidad adecuada de proteína de fusión GST-A en hielo. 4: Coloque 50-70 ul de perlas de GST (glutatión inmovilizado) en tubos EP y lave con 800 ul de PBS + Triton-100 al 1 %. Una vez, mezcle la proteína de fusión GST congelada. -A5:PBS+1% Tritón-100 3 veces, PBS 3 veces. Deje 20ul(PBS+perlas) como cotización. 6. Escinda la proteína de fusión B eucariótica al mismo tiempo, agote el medio de cultivo, lave una vez con PBS (RT), agregue 300 ul de solución de lisis (tome 6 pocillos como ejemplo, PBS + 1% Triton-100 + cock taier), y dejar reposar a 4°C 30 minutos. 7: Soplar en un tubo EP de 1,5 ml y triturar con ultrasonido. 65438±03000 rpm, 65438±05 minutos, centrifugar a 4°C para tomar el sobrenadante. 8: Cuantificación de proteína BCA (opcional) Deje 20 ul como cotización, agregue la muestra restante al tubo EP de proteína purificada y use PBS para completar el líquido hasta aproximadamente 600 ul para combinar completamente la proteína. Girar y combinar O/N9:PBS+1% Triton-100 3 veces a 4°C, PBS 3 veces. 10: Disuelva la proteína en las perlas en 40 UL de tampón de carga 5X, hierva durante 3 minutos, centrifugue a alta velocidad y realice la detección por Western Blot en Run-SDS PAGE. Seque usando HA o myc. Preste atención a la comparación de GST: menú desplegable. (Tome A-GST y B-6*His como ejemplos) 1. Al ejecutar SDS-PAGE, utilice una proteína de entrada (es decir, B-6*His) como control positivo para ver si hay algún problema con los reactivos y los procedimientos operativos durante las operaciones occidentales. 2. Solo con proteína GST, ingrese B-6*His y utilícelo como control negativo para observar si GST interactúa con la proteína de entrada. Protocolo de inmunoprecipitación o menú desplegable de GST 1. Lavar la monocapa celular una vez con PBS frío. 2. Utilice propionato de 3,3'-ditioditiosuccinimida/PBS 2 mM a 4? para entrecruzar proteínas relacionadas. (Opcional) 3. Quite la batería y gírela a 4? Ejecute a 1000 rpm durante 5 minutos. 4. Decantar el líquido sobrenadante. 5. Resuspender el sedimento celular en una cantidad adecuada de tampón IP A, sonicarlo al 40 % durante 10 segundos e incubar a 4 °C durante 45 minutos. 6. ¿Gira 4 a máxima velocidad? Dura 5 minutos. 7. Recupere el sobrenadante y detecte la concentración de proteínas utilizando el reactivo de Bradford (Bio-Rad). 8. Tome 500ug de proteína y mézclelos con 4 veces el volumen de IP-buffer b. Los lisados ​​se purificaron previamente añadiendo 1 ug de IgG normal y 5 ul de perlas de proteína G (Sigma) a 4 ? c es 1 hora. Para el análisis desplegable de GST, agregue 1 ug de proteína GST y 5 ul de perlas de glutatión-Sefarosa 4B. 10. ¿Girar la cuenta a las 4 en punto? c durante 3 minutos a 10.000 rpm. 11. Recoger el sobrenadante, añadir 1 ug de anticuerpo específico o IgG normal y colocar en un rotador a 4? Dura 2 horas. Para el análisis desplegable de GST, agregue 1 ug de proteína específica de fusión GST o cantidades equimolares de proteína GST. 12. Agregue 5 ul de perlas de proteína G o glutatión-sefarosa 4B e incube durante otras 2 horas o toda la noche. 13. ¿Girar la cuenta a las 4 en punto? Ejecute a 2000 rpm durante 3 minutos. Nota: Habrá algunas partículas blancas encima de las perlas en la pared del tubo, lo que se debe a la precipitación de proteínas causada por la desnaturalización.

Elimine estos precipitados, de lo contrario producirán bandas de unión falsas en los grupos de control y experimentales, afectando la interpretación de los resultados. Verifique este fenómeno durante cada paso de lavado. 14. Utilice 1 ml de tampón de lavado IP en un rotador a 4? Dura 5 minutos. 15. ¿Girar la cuenta a las 4 en punto? Ejecute a 2000 rpm durante 3 minutos. 16. Repita los pasos 14 y 15 tres veces más. 17. Resuspender el sedimento en 25 ul de tampón de carga 1xSDS e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. 18. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. 19. Recoger el sobrenadante y colocarlo a –20? O realizar electroforesis SDS-PAGE. 20. Para el control de entrada, se incluirán 25 ug de proteína en el análisis del gel. Nota: Para evitar la interferencia de la cadena pesada de IgG en proteínas específicas con un peso molecular de alrededor de 50 kD, puede utilizar un tampón de carga SDS 1x que no contenga β-mercaptoetanol ni DTT. En estas condiciones, el enlace entre cadenas cisteína-cisteína se mantendrá, produciendo una banda de IgG de alrededor de 100 KD. Tampón IP A: 50 mm Tris-Cl pH 7,5 150 mm NaCl 1 mm EDTA pH 8,0 Triton X-100 al 0,5% más inhibidor de proteasa (Roche) Tampón IP B: Tampón IP A menos Triton X-100. Tampón de lavado IP: 50 mm Tris-Cl PH 7,5 150 mm NaCl