scNT-Seq || Tecnología de secuenciación unicelular que diferencia los ARN recién generados
La secuenciación de ARN unicelular proporciona la expresión de todo el transcriptoma, pero el scRNAseq común no puede distinguir el ARN recién generado del ARN preexistente. Aquí, presentamos la secuenciación de firmas de transcripciones de novo unicelulares (scNT-Seq), un método para el análisis masivo en paralelo de transcripciones de novo y ARN preexistentes en la misma célula. Comúnmente utilizado para distinguir el ARN antiguo y el nuevo, se pueden utilizar etiquetas análogas de nucleósidos exógenos, como la 4-tiourea (4sU), que puede marcar el ARN recién generado y convertir 4sU en análogos de citosina (C) mediante métodos de conversión química, etiquetando así de manera efectiva el recién transcrito. ARN con firmas metabólicas de conversión de T a C.
scNT-seq es un método scRNA-seq de alto rendimiento basado en UMI que combina el etiquetado de ARN metabólico, microfluidos de gotitas y la conversión de 4sU inducida químicamente a análogos de citosina para medir simultáneamente dentro de la misma célula nuevos y ARN antiguo.
scNT-seq incluye principalmente los siguientes pasos:
(1) Marcado metabólico de las células mediante 4sU (2 - 3) Encapsulación simultánea de células individuales y oligo(dT) con códigos de barras; Perlas recubiertas con cebador en una gotita a nanoescala; (4) conversión química de 4sU en la gotita; (5 - 8) transcripción inversa, amplificación de ADNc, etiquetado y PCR (9) utilizando estadísticas basadas en UMI. El modelo analiza la transcripción T-to; -C sustituciones para inferir la proporción de nuevas transcripciones.
ScNT-seq se puede utilizar para analizar cambios dinámicos en el ARN intracelular, actividades de la red reguladora de genes y análisis de trayectoria del estado celular. Utilizaron células neuronales corticales primarias como sistema modelo para evaluar el rendimiento de scNT-seq en la cuantificación de ARN nuevo y antiguo. Descubrieron que casi no había expresión en el ARN antiguo que respondiera a la actividad genética a lo largo del tiempo (c). Mediante el análisis SCENIC, encontraron TF que se expresaban específicamente en diferentes etapas de activación en diferentes grupos de células (d).
Texto original: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2019.12.19.882050v2