Cómo operar el kit de extracción de ADN
La operación completa dura aproximadamente 1 hora y se divide en homogeneización, lisis celular, eliminación de proteínas, purificación de ADN y otros pasos.
Homogeneización y lisis celular:
El uso de diferentes materiales experimentales requiere diferentes pasos de homogeneización. Las instrucciones específicas son las siguientes:
Extracción de genomas de ADN de tejidos animales
p>
Cuando se utiliza un mortero para homogeneización:
① Tomar de 1 a 100 mg de tejido animal o tejido humano, pasarlo a un mortero preenfriado en un baño de hielo y molerlo rápidamente y Homogeneizar vigorosamente.
Nota) Agregue nitrógeno líquido y muela los siguientes pañuelos hasta obtener forma de polvo.
A. Páncreas, bazo, timo, linfa y otros tejidos ricos en ADNasa.
B． Tejidos como la piel y los tendones que son ricos en colágeno.
C. Tejidos ricos en queratina o tejidos duros (como los huesos), etc.
② Añadir 650 μl de Solución A y 0,9 μl de RNasa A1, y triturar suavemente durante 30 segundos.
Nota) Cuando utilice los materiales experimentales de ①-Nota) anterior, agregue la Solución A y la ARNasa A1 y muela el mortero en un baño de agua a 65 °C durante 1 minuto.
③ Recoja 650 μl de homogeneizado de tejido molido y transfiéralo al tubo de recolección. Si el volumen del homogeneizado es inferior a 650 μl, agregue la solución A a 650 μl e incube a 65 °C durante 5 minutos.
Cuando utilice una varilla trituradora para la homogeneización:
① Tome de 1 a 100 mg de tejido animal o tejido humano y transfiéralo a un tubo de recolección preenfriado en un baño de hielo, y tritúrelo rápidamente con una varilla de molienda.
② Añadir 350 μl de Solución A y 0,9 μl de RNasa A1 y triturar rápidamente con una varilla abrasiva hasta formar un homogeneizado.
③ Agregue 350 μl de Solución A y vierta el homogeneizado en la varilla de molienda en el tubo de recolección. Agite y mezcle bien e incube a 65 °C durante 5 minutos.
Extraer ADN genómico de materiales vegetales o células de cultivos vegetales
① Pesar una cantidad adecuada de materiales vegetales frescos según la siguiente tabla (si se utilizan materiales vegetales liofilizados, la cantidad se reduce a la mitad), cortar en trozos pequeños y ponerlos en un mortero, agregar nitrógeno líquido y, una vez que la muestra esté completamente congelada, triturarla rápida y fuerte hasta que se convierta en polvo. Se debe agregar nitrógeno líquido de forma intermitente durante la molienda para evitar que el material se derrita.
Tipos de material vegetal
Uso de material vegetal*
Flores y hojas de plantas
10～100 mg
Tallos de plantas
60～240 mg
Raíces de plantas
80～240 mg
Semillas de plantas
80 ～240 mg
* Si selecciona raíces de plantas, semillas y otras muestras, debido a que el contenido de ADN genómico es muy bajo, debe utilizar una dosis que supere los parámetros que se muestran en la tabla. realice los pasos en dos tubos Para las operaciones experimentales 1 a 6, en la operación del paso 7, agregue las soluciones en cada tubo a la misma columna de centrifugación en lotes y filtre, de modo que el ADN genómico en cada tubo quede unido al. misma columna de giro.
Si el ADN genómico se extrae de células vegetales cultivadas, centrifugue para recolectar 2×103~1×107 células vegetales cultivadas, agregue 150 μl de agua para suspender completamente las células y luego transfiéralas a un mortero. agregue nitrógeno líquido. Muele rápida y vigorosamente hasta obtener un polvo.
Nota) La molienda de muestras debería ser suficiente; de lo contrario, el rendimiento de ADN genómico se verá seriamente afectado.
② Mueva el mortero a un baño de agua a 65 °C. Cuando el polvo de la muestra apenas comience a derretirse, agregue 700 μl de Solución A y 1,2 μl de RNasa A1 al mortero y muela vigorosamente durante 30 segundos.
③ Recoja 650 μl de homogeneizado de tejido molido y transfiéralo al tubo de recolección. Si el volumen del homogeneizado es inferior a 650 μl, agregue la solución A a 650 μl. Mantener caliente a 65°C durante 15 minutos.
Nota) Al procesar raíces/tallos ricos en fibra y otros materiales vegetales o semillas ricas en almidón y proteínas, el tiempo del baño de agua se puede extender a 60 minutos.
Extraer ADN genómico de sangre completa
① Tome de 10 a 250 μl de sangre completa (que contenga anticoagulante) y agréguela al tubo de recolección.
② Añadir 500 μl de Solución A.
③ Añadir 1 μl de RNasa A1, agitar vigorosamente durante 15 segundos y luego incubar en hielo durante 5 minutos.
Nota) El volumen de procesamiento único de sangre total anticoagulada de humanos y animales es ≤250 μl; el volumen de procesamiento único de sangre total anticoagulada de aves y anfibios es ≤10 μl.
Extraiga ADN genómico de células cultivadas
3. Cuando utilice células animales cultivadas en suspensión:
① Utilice el tubo de recolección para recolectar 1×105～1,5×107. Centrifugar la suspensión celular a 5000 rpm durante 5 minutos y desechar el sobrenadante (medio de cultivo celular).
② Añadir 150 μl de agua destilada esterilizada o PBS para suspender las células.
③ Añadir 500 μl de Solución A y 0,8 μl de RNasa A1, agitar vigorosamente durante 15 segundos y luego dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto.
4. Cuando utilice células adherentes:
① Desechar el medio de cultivo, añadir 650 μl de Solución A al plato de cultivo y dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto.
Nota) Si cada pocillo de una placa de 96 pocillos, etc., no puede contener 650 μl de solución a la vez, procese las células varias veces.
② Utilice la punta de la pipeta para eliminar las células cultivadas adherentes y transfiera 650 μl de suspensión celular al tubo de recolección.
③ Añadir 0,8 μl de RNasa A1, agitar vigorosamente durante 15 segundos y luego dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto.
2. Añadir 400 μl de Solución B y agitar para mezclar.
3. Añadir 1 ml de Solución C preenfriada a 4°C, mezclar bien y centrifugar a 12.000 rpm durante 2 minutos.
4. Deseche la fase orgánica superior, luego agregue 1 ml de Solución C preenfriada a 4°C, mezcle bien y centrifugue a 12.000 rpm durante 2 minutos.
5. Deseche la fase orgánica superior, luego transfiera la solución de la fase acuosa (capa inferior incolora) al vaso de filtro colocado en el tubo de recolección y centrifugue a 12.000 rpm durante 1 minuto.
Nota) La fase orgánica (capa superior) está coloreada, así que asegúrese de eliminarla, de lo contrario evitará que el ADN se una a la membrana de preparación de ADN. No es necesario considerar la precipitación de interfase y se eliminará durante la filtración.
6. Deseche la copa del filtro, agregue 400 μl de tampón DB al filtrado y mezcle uniformemente.
7. Coloque la columna de giro del kit en el tubo de recolección. Transfiera la solución mezclada en el paso 6 anterior a la columna de centrifugación, centrifugue a 12 000 rpm durante 1 minuto y deseche el filtrado.
8. Añadir 500 μl de Rinse A a la columna de centrifugado, centrifugar a 12.000 rpm durante 30 segundos y desechar el filtrado.
9. Añadir 700 μl de Rinse B a la columna de centrifugado, centrifugar a 12.000 rpm durante 30 segundos y desechar el filtrado.
Nota) Agregue Enjuague B alrededor de la pared de la columna de giro, lo que ayudará a eliminar completamente la sal adherida a la pared.
10. Repita el paso 9.
11. Coloque la columna de centrifugación en un tubo de centrífuga nuevo de 1,5 ml, agregue de 50 a 200 μl de agua destilada esterilizada o tampón de elución en el centro de la membrana de la columna de centrifugación y déjela reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto.
Nota) Calentar agua destilada esterilizada o tampón de elución a 65 °C ayudará a mejorar la eficiencia de la elución.
12. Centrifugar a 12.000 rpm durante 1 minuto para eluir el ADN.
Si el laboratorio cuenta con un dispositivo de presión negativa adecuado para la interfaz de la columna de giro, puede realizar las siguientes operaciones después de completar el paso 6 anterior.
7. Inserte la columna de giro del kit en el conector del dispositivo de presión negativa, transfiera la solución mezclada en el paso 6 anterior a la columna de giro, encienda el dispositivo de ajuste de presión negativa y succione lentamente. la solución de columna de centrifugado (caudal controlado a 1 gota/segundo).
8. Ajuste la presión negativa al máximo, agregue 500 μl de Rinse A a la columna de centrifugado y absorba toda la solución en la columna de centrifugado.
9. Añadir 700 μl de Rinse B a la columna de centrifugado y absorber toda la solución en la columna de centrifugado.
Nota) Agregue Enjuague B alrededor de la pared de la columna de giro, lo que ayudará a eliminar completamente la sal adherida a la pared.
10. Repita el paso 9. Luego retire la columna de centrifugado del dispositivo de presión negativa, colóquela en el tubo de recolección del kit y centrifugue a 12 000 rpm durante 1 minuto.
11. Coloque la columna de centrifugación en un tubo de centrífuga nuevo de 1,5 ml, agregue de 50 a 200 μl de agua destilada esterilizada o tampón de elución en el centro de la membrana de la columna de centrifugación y déjela reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto.
Nota) Calentar agua destilada esterilizada o tampón de elución a 65 °C ayudará a mejorar la eficiencia de la elución.
12. Centrifugar a 12.000 rpm durante 1 minuto para eluir el ADN.