Problemas reales con el ácido nucleico de la PCR
Preguntas frecuentes sobre la PCR:
El tiempo de detección por electroforesis para los productos de PCR es generalmente inferior a 48 horas y algunos son mejores que la detección por electroforesis el mismo día. Después de más de 48 horas, las bandas se vuelven irregulares o incluso desaparecen.
Falso negativo
No aparece ninguna banda amplificada.
Los aspectos clave de la reacción de PCR son ① la preparación del ácido nucleico molde, ② la calidad y especificidad del cebador, ③ la calidad de la enzima y el uso de bromuro de etidio, ④ las condiciones del ciclo de PCR. Para encontrar las razones, también debemos analizar y estudiar los enlaces anteriores.
Plantilla: ① La plantilla contiene proteínas, ② La plantilla contiene inhibidores de la enzima Taq, ③ Las proteínas de la plantilla no han sido digeridas ni eliminadas, especialmente las histonas en los cromosomas, ④ La plantilla se ha perdido durante la extracción. y preparación. Demasiado o inhalación de fenol. ⑤El ácido nucleico plantilla no está completamente desnaturalizado. Cuando la calidad de la enzima y los cebadores es buena, no hay banda de amplificación, lo que probablemente se debe a un fallo en la digestión de la muestra y en el proceso de extracción del ácido nucleico molde. Por lo tanto, para preparar un jugo digestivo eficaz y estable, el procedimiento debe ser fijo y no puede modificarse a voluntad.
Negativo; Negativo; Negativo
Cabe señalar que en ocasiones se olvida la enzima Taq o el bromuro de etidio.
Cebadores: La calidad del cebador, la concentración del cebador y si la concentración de los dos cebadores es simétrica son razones comunes para el fallo de la PCR o bandas de amplificación insatisfactorias, que son fáciles de dispersar. Existen problemas con la calidad de la síntesis de cebadores en algunos lotes. Uno de los dos cebadores tiene una concentración alta y el otro tiene una concentración baja, lo que da como resultado una eficiencia de amplificación asimétrica baja. Las contramedidas incluyen: ① Seleccionar una buena unidad de síntesis de cebadores. ②La concentración de los cebadores depende no solo del valor de DO, sino también de la electroforesis en gel de agarosa de la solución madre del cebador. Debe haber una banda de cebador y el brillo de las dos bandas de cebador debe ser aproximadamente el mismo. Por ejemplo, si un cebador tiene una banda y el otro no, la PCR puede fallar. Deberá negociar con la unidad de síntesis de cebadores para resolver el problema. Si una imprimación tiene un brillo alto y otra tiene un brillo bajo, equilibre las concentraciones al diluir la imprimación. (3) Los imprimadores deben almacenarse en paquetes pequeños de alta concentración para evitar que se deterioren debido a la congelación y descongelación repetidas o al almacenamiento prolongado en el refrigerador. ④El diseño del cebador no es razonable. Si la longitud del cebador no es suficiente, se formarán dímeros entre los cebadores.
Concentración de Mg2: La concentración de iones Mg2 tiene un gran impacto en la eficiencia de la amplificación por PCR. Una concentración demasiado alta reducirá la especificidad de la amplificación por PCR, y una concentración demasiado baja afectará el rendimiento de la amplificación por PCR o incluso hará que la amplificación por PCR falle sin producir una banda de amplificación.
Cambios en el volumen de reacción: Habitualmente, los volúmenes utilizados para la amplificación por PCR son 20ul, 30ul y 50ul. O 100ul. El volumen que se utilizará para la amplificación por PCR se establece en función de los diferentes propósitos de la investigación científica y las pruebas clínicas. Cuando haga volúmenes pequeños, como 20 ul, asegúrese de configurar las condiciones del modo; de lo contrario, fallará fácilmente.
Razones físicas: la desnaturalización es muy importante para la amplificación por PCR. Si la temperatura de desnaturalización es baja y el tiempo de desnaturalización es corto, es fácil producir falsos negativos. amplificación y reducir la eficiencia de amplificación específica. Una temperatura de hibridación excesivamente alta afectará la unión de cebadores y plantillas y reducirá la eficiencia de la amplificación por PCR. A veces es necesario utilizar un termómetro estándar para detectar las temperaturas de desnaturalización, recocido y extensión en el amplificador o en el recipiente soluble en agua, lo que también es una de las razones del fallo de la PCR.
Variación de la secuencia diana: Si la secuencia diana está mutada o eliminada, lo que afecta la unión específica del cebador y el molde, o el cebador y el molde pierden la secuencia complementaria debido a la eliminación de un cierto segmento de la secuencia objetivo, la amplificación por PCR fallará.
Falso positivo
La banda de amplificación por PCR es consistente con la banda de la secuencia objetivo y, en ocasiones, la banda es más clara y brillante.
Diseño de cebador inadecuado: La secuencia de amplificación seleccionada tiene homología con la secuencia de amplificación no objetivo, por lo que al realizar la amplificación por PCR, el producto de PCR amplificado es una secuencia no objetivo. Si la secuencia objetivo es demasiado corta o el cebador es demasiado corto, pueden producirse falsos positivos. Es necesario rediseñar los cebadores.
Contaminación cruzada de secuencias objetivo o productos de amplificación: Hay dos razones para esta contaminación: en primer lugar, la contaminación cruzada de todo el genoma o de fragmentos grandes conduce a falsos positivos. Este falso positivo se puede abordar manipulando la secuencia objetivo con cuidado y suavidad para evitar que la secuencia objetivo sea succionada por la pistola de carga o se derrame fuera del tubo de centrífuga. Todos los reactivos o equipos, excepto las enzimas y sustancias que no pueden soportar altas temperaturas, deben esterilizarse en autoclave. Los tubos de centrífuga y las puntas de pipeta de inyección utilizados deben utilizarse una vez. Si es necesario, los tubos de reacción y los reactivos se irradian con luz ultravioleta antes de añadir la muestra para destruir los ácidos nucleicos presentes. El segundo es la contaminación de pequeños fragmentos de ácidos nucleicos en el aire. Estos pequeños fragmentos son más cortos que la secuencia objetivo, pero tienen cierta homología. Se pueden empalmar entre sí y, después de ser complementarios de los cebadores, los productos de la PCR se pueden amplificar, lo que da como resultado falsos positivos, que pueden reducirse o eliminarse mediante PCR anidada.
Aparecen bandas de amplificación no específicas
Las bandas después de la amplificación por PCR no coinciden con el tamaño esperado, ya sean más grandes o más pequeñas, o hay bandas de amplificación específicas y bandas de amplificación no específicas. Las bandas aparecen al mismo tiempo. Hay dos razones para la aparición de bandas no específicas: primero, el cebador no es completamente complementario a la secuencia objetivo, o el cebador se agrega para formar un dímero. En segundo lugar, una concentración demasiado alta de iones Mg2 y una temperatura de recocido demasiado baja están relacionadas con demasiados ciclos de PCR. El segundo es la calidad y cantidad de la enzima. A menudo, algunas enzimas de determinadas fuentes son propensas a formar bandas no específicas pero otras no. A veces, si la cantidad de enzima es demasiado alta, se producirá una amplificación no específica. Esto es lo que debe hacer: Rediseñe la guía si es necesario. Reduzca la cantidad de enzima utilizada o reemplace la enzima de otra fuente. Reduzca la cantidad de cebadores, aumente la cantidad de plantilla de manera adecuada y reduzca el número de ciclos. Aumente la temperatura de recocido adecuadamente o utilice el método de punto de temperatura dual (desnaturalización a 93 °C, extensión del recocido a aproximadamente 65 °C).
Hay tiras de tracción o tiras untables descascaradas.
La amplificación por PCR a veces produce bandas manchadas, en forma de láminas o en forma de alfombras. Las razones suelen ser demasiada enzima o mala calidad de la enzima, una concentración demasiado alta de dNTP, una concentración demasiado alta de Mg2, una temperatura de recocido demasiado baja y demasiados ciclos. La contramedida es: reducir la dosis de enzima o reemplazar la enzima con otras fuentes. ②Reducir la concentración de dNTP. Reducir adecuadamente la concentración de Mg2. Aumente el número de plantillas y reduzca el número de bucles.