Principio de medición de la concentración de proteínas mediante el método bca
La detección de la concentración de proteína BCA es un experimento que puede calcular la concentración de proteína en función del valor de absorbancia. En condiciones alcalinas, la proteína reduce el Cu2 a Cu y el Cu forma un complejo púrpura con el reactivo BCA. La molécula BCA quela un Cu. Compare el valor de absorción del complejo soluble en agua a 562 nm con la curva estándar para calcular la concentración de la proteína a analizar.
Las concentraciones utilizadas habitualmente de los detergentes SDS, Triton X-100 y Tween no afectan a los resultados de las pruebas, pero sí se ven afectadas por agentes quelantes (EDTA, EGTA), agentes reductores (DTT, mercaptoetanol) y lípidos. Durante el experimento, si descubre que el valor de fondo del diluyente de la muestra o del lisado en sí es alto, puede probar el kit de determinación de la concentración de proteína Bradford.
Introducción
Los iones de cobre divalentes pueden reducirse a iones de cobre monovalentes mediante proteínas en condiciones alcalinas. Los iones de cobre monovalentes interactúan con la exclusiva solución BCA A (que contiene BCA). reacciones de color. Dos moléculas de BCA quelan un ion cobre, formando un complejo de reacción de color púrpura. Este complejo soluble en agua muestra una fuerte absorbancia a 562 nm. Existe una buena relación lineal entre la absorbancia y la concentración de proteínas en un amplio rango, por lo que la concentración de proteínas se puede calcular en función del valor de absorbancia.
Reactivos experimentales
(1) Preparación del reactivo BCA
① Reactivo A, 1L: Pesar 10g BCA (1) y 20g Na2CO3·H2O (2) , 1,6 g de Na2C4H4O6 · 2H2O (0,16), 4 g de NaOH (0,4), 9,5 g de NaHCO3 (0,95), agregue agua hasta 1 litro, ajuste el valor del pH a 11,25 con NaOH o NaHCO3 sólido.
②Reactivo B, 50ml: Tomar 2g CuSO4·5H2O (4), añadir agua destilada hasta 50ml.
③Reactivo BCA: Tome 50 partes de reactivo A y 1 parte de reactivo B y mézclelos uniformemente. Este reactivo es estable durante una semana.
(2) Solución proteica estándar: Pesar 0,5 g de albúmina sérica bovina, disolverla en agua destilada y ajustar el volumen a 100 ml para obtener una solución de 5 mg/ml. Diluir diez veces cuando se use.