El impacto de la detección multiparamétrica FLAER en la clonación de HPN
La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) es una enfermedad clonal adquirida de células madre hematopoyéticas. Su patogénesis se debe principalmente a cambios en el cromosoma X de las células somáticas. El gen PIG-A conduce a una síntesis desordenada de anclajes de fosfatidilinositol glicosilado (GPI) en la superficie de la membrana de las células sanguíneas y a la pérdida de proteínas de unión de anclaje. Los métodos de diagnóstico tradicionales incluyen principalmente la prueba de hemólisis de sacarosa, la prueba de hemólisis ácida y la prueba de Routh, pero la sensibilidad y especificidad de estos métodos son deficientes. En los últimos años, la detección de CD55 y CD59 por citometría de flujo se ha convertido en un método de rutina para diagnosticar la HPN. En particular, CD59 es más sensible que CD55 y se considera un mejor indicador para diagnosticar la HPN. Las variantes marcadas con fluorescencia del precursor de aerolisina hidrofila inactivada (FLAER) pueden unirse específicamente a proteínas ancladas a GPI, y su especificidad y sensibilidad son superiores a los métodos tradicionales de citometría de flujo. La HPN, la anemia aplásica (AA) y el síndrome mielodisplásico (SMD) son enfermedades de insuficiencia de la médula ósea con patogénesis y manifestaciones clínicas similares, y el diagnóstico diferencial temprano suele ser difícil. Este artículo combina FLAER, CD45, CD15 y CD24 para detectar clones de HPN de granulocitos y CD59 para detectar clones de HPN de eritrocitos, lo que mejora eficazmente la sensibilidad y especificidad de la detección de clones de HPN y ayuda en el diagnóstico diferencial temprano de enfermedades de insuficiencia de la médula ósea. El informe sigue.
1 Datos y métodos
1.1 Información general Todos los casos proceden de 48 pacientes ingresados consecutivamente en el Servicio de Hematología de nuestro hospital. Entre ellos, 9 pacientes con HPN y 13 con AA, cuyo diagnóstico cumplía con los estándares diagnósticos y terapéuticos de enfermedades hematológicas. Un total de 11 pacientes con SMD cumplieron los criterios de clasificación diagnóstica de la OMS de 2008. Los 15 pacientes del grupo de control eran todos pacientes con anemia megaloblástica.
1.2 Instrumentos y reactivos El citómetro de flujo FACSAria, hemolisina, solución salina tampón fosfato (PBS) y los reactivos CD59, CD45, CD15 y CD24 se adquirieron de BD Company, y los reactivos FLAER se compraron de Protox Biotechnology de Canadá. .
1.3 Método
1.3.1 Detectar glóbulos rojos CD59 de sangre periférica. Tomar 100 μL de sangre entera anticoagulada con EDTA, lavar con PBS, diluir con 1,5 ml de PBS, tomar 100 μL y agregar. 20 μL de monómero CD59-PE Clonar el anticuerpo e incubar a 4°C en la oscuridad durante 30 minutos. Lavar dos veces con 2 ml de solución de PBS, resuspender en 1 ml de solución de PBS y detectar por computadora. Se utilizó citometría de flujo para detectar la tasa de expresión de las células CD59.
1.3.2 Detección de FLAER de granulocitos en sangre periférica: tomar 100 μl de sangre completa anticoagulada con EDTA, agregar 20 μl de anticuerpos CD45, CD15, CD24 y FlAER respectivamente, incubar en la oscuridad durante 30 minutos, luego agregar 2 ml de hemolisina y mantener a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos, después de completar la hemólisis, 65438. Deseche el sobrenadante, lave dos veces con 2 ml de solución de PBS, resuspenda en 500 l de solución de PBS para la detección de la máquina líquida y mida la tasa de expresión de FLAER con citometría de flujo.
Para el análisis de los datos se utilizó el software SPSS17.0. Los datos de medición se expresaron como >
2.1 Características clínicas Hubo 9 pacientes con HPN, incluidos 6 hombres y 3 mujeres, con edades entre 16 y 60 años. con una edad media de 30 años. Hubo 13 pacientes con AA, incluidos 5 hombres y 8 mujeres, con edades comprendidas entre 7 y 63 años, con una mediana de edad de 38 años. Hubo 11 pacientes con SMD, 5 hombres y 6 mujeres, de 41 a 72 años, con una mediana de edad de 53 años, incluidos RCMD 1, RCUD 6, RAEB-I 2, RAEB-II 1 y síndrome 5q 65.438. Había 15 pacientes en el grupo de control, incluidos 6 hombres y 9 mujeres, de edades comprendidas entre 19 y 61 años, con una mediana de edad de 34 años.
2.2 Al comparar diferentes métodos de detección en pacientes con HPN, las tasas de deleción de FLAER y CD59 en pacientes con HPN fueron (70,07 ± 28,77) % y (38,51,29,1,05) % respectivamente, que fueron significativamente más altas que las de los pacientes con HPN. En el grupo de control, grupo AA y grupo MDS, la diferencia fue estadísticamente significativa (P
2.3 Comparación de diferentes métodos para detectar pacientes sin HPN La tasa promedio de eliminación de FLAER en cada grupo fue mayor que la de CD59 , pero la diferencia no fue estadísticamente significativa (P & gt0,05), lo que indica que no hay diferencias significativas entre FLAER y CD59 en el grupo sin HPN. En el grupo de control, la tasa de eliminación de FLAER fue del 0,0% y la especificidad. fue del 100% Hubo 3 casos de eliminación de CD59, y la tasa de eliminación fue inferior a 65438 ± 0% en 5 casos. Se detectó eliminación de FLAER en 4 casos y se detectó eliminación de CD59 en 11 pacientes. , incluida la eliminación de CD59 en 1 paciente. Los resultados mostraron que FLAER era menos que CD59.
3 Discusión
Hasta la fecha, se ha encontrado que más de 20 proteínas. ser deficiente en la expresión de las células sanguíneas en pacientes con HPN, incluido el factor acelerador de la descomposición (CD55) y la reacción en la membrana de los glóbulos rojos. La pérdida de CD59 se considera la principal causa de la fisiopatología de la HPN. Los glóbulos rojos y la fuerte expresión de anticuerpos son las mejores células objetivo para la detección sensible, especialmente en algunas enfermedades con granulocitopenia y MDS, la detección de glóbulos rojos es particularmente importante al comparar los valores de los rojos. glóbulos rojos y glóbulos blancos, se puede proporcionar más información para uso clínico. Sin embargo, la expresión de las moléculas CD55 en los glóbulos rojos es fuerte y uniforme, lo que se ha convertido en la causa de la HPN en los últimos años. , cada vez más estudios han encontrado que la detección de la expresión de CD59 en los glóbulos rojos tiene ciertas limitaciones en el diagnóstico de la HPN.
Este estudio encontró que dos pacientes del grupo de HPN entre ellos, la tasa de eliminación de CD59 era. 5,5% en un paciente y 2,9% en el otro, mientras que las tasas de deleción de FLAER fueron de 23,2% y 47,7% respectivamente. Esto puede deberse a que el paciente se encontraba en la etapa activa de la enfermedad y recibió tratamiento de transfusión de sangre, que afectó a los glóbulos rojos. La expresión de CD59 conduce a falsos positivos para la expresión de CD59. Los estudios han demostrado que en pacientes con anemia microcitocromática, la expresión de CD59 en la superficie de los glóbulos rojos está reducida, pero la expresión de CD59 en los glóbulos rojos es normal. Además, durante el proceso de envejecimiento de las células normales, la molécula de superficie CD59 puede perderse espontáneamente, lo que resulta en desviaciones entre los valores de detección y los hechos. Con el desarrollo continuo de la tecnología, la tecnología FLAER es un gas hidrófilo inactivo marcado con Alexa-488. Las variantes de los precursores de monolisina pueden unirse específicamente a las proteínas de anclaje de GPI y se expresan específicamente en todos los granulocitos con proteínas de anclaje de GPI. El número y el tipo de proteínas de anclaje de GPI expresadas por diferentes células no diferirán ni provocarán errores. Debido a que FLAER puede detectar directamente proteínas GPI, ayuda a identificar verdadera HPN y citopenias inmunes, y a identificar verdaderas células GPI negativas. En este estudio, la tasa de eliminación de FLAER en el grupo de control fue 0 y los resultados de detección fueron más específicos que CD59. En el grupo de HPN, la tasa de eliminación de FLAER fue significativamente mayor que la de CD59 y la sensibilidad fue mayor. FLAER es también el mejor anticuerpo para evitar que aparezcan células contaminantes en la puerta. Si una pequeña cantidad de células que expresan CD24 negativas están contaminadas dentro de la puerta, pueden confundirse con pequeños clones de HPN. El uso combinado de FLAER y CD24 puede mejorar la precisión de la detección de HPN. La población de células doble negativa CD24/FLAER es la verdadera población de células clonales de HPN. Las pruebas multiparamétricas FLAER requieren que las muestras de sangre periférica se envíen para su análisis de manera oportuna después de su recolección, de lo contrario, la tasa de supervivencia de los granulocitos disminuirá y aumentará la tinción no específica de las células, lo que afectará el efecto de detección. Esto afecta en cierta medida la aplicación clínica de FLAER. La detección de clones de HPN es de gran importancia para las manifestaciones clínicas, el tratamiento y el pronóstico de los SMD y la anemia aplásica. Algunos pacientes con AA con clones de HPN tienen mejores efectos de inmunoterapia. Incluso si el clon es inferior al 0,1%, el efecto del tratamiento se verá afectado.
Para pacientes con AA con una pequeña cantidad de clones de HPN, es necesario monitorear los cambios en los clones de HPN porque los pacientes pueden desarrollar anemia hemolítica. En este estudio, la relación entre HPN y SMD se limitó a SMD de bajo riesgo, que se caracteriza por citopenias e hipomieloproliferación.
La incidencia de anomalías genéticas es baja, el curso clínico es lento y la insuficiencia de la médula ósea es más común. La tasa de eliminación de FLAER en el grupo AA y el grupo MDS fue mayor que la de CD59. Debido a que es difícil distinguir AA de SMD hipoproliferativos, hasta la fecha no ha habido informes de pacientes con SMD que hayan progresado a HPN. El seguimiento de los clones de HPN tiene cierta importancia en la diferenciación de estas dos enfermedades. Los clones de HPN detectados en pacientes con AA y SMD suelen ser muy pequeños y no se detectan fácilmente mediante ensayos de CD59. Ambos grupos de pacientes fueron 1 y la tasa de eliminación de CD59 fue 0, mientras que se perdió la expresión de FLAER y las tasas de eliminación fueron del 4,2% y el 2,9% respectivamente. La prueba FLAER es más sensible que la CD59. Debido a que la AA, el SMD aplásico y la HPN son enfermedades de insuficiencia de la médula ósea con patogénesis, manifestaciones clínicas y características biológicas similares, es difícil distinguirlas. La prueba FLAER es más sensible y específica que la CD59. Puede proporcionar una base más sensible y específica para la clonación de HPN en una etapa temprana. Para los pacientes con sospecha de HPN que tienen síntomas clínicos atípicos y un diagnóstico poco claro, la prueba FLAER puede ayudar con el diagnóstico temprano o la exclusión. Por lo tanto, la detección altamente sensible de clones de HPN por parte de FLAER, el diagnóstico y la identificación de estas tres enfermedades, tienen cierta importancia para comprender el proceso clínico, el pronóstico y el resultado.
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