Ciencia|Los científicos descubren un nuevo objetivo que puede evitar que la enfermedad de Parkinson empeore.
2018 165438+El 2 de octubre, el equipo de Valina L. Dawson y Ted M. Dawson del Centro de Enfermedades Neurodegenerativas e Investigación de Células Madre de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins en Estados Unidos publicó un artículo in Science publicó un artículo titulado Poli (ADP-ribosa). En el artículo de investigación "Impulso de la neurodegeneración patológica de la α-sinucleína en la enfermedad de Parkinson", se descubrió que la poli (ADP-ribosa) puede mejorar la toxicidad de la α-sinucleína, promover la agregación de α-sinucleína y participar en la patología del daño celular mediado por α-sinucleína. , promoviendo así la progresión de la EP. Este descubrimiento puede proporcionar un objetivo terapéutico para prevenir la progresión de la EP [1]. La revista "Science" también publicó un artículo de revisión sobre el resultado de esta investigación [2].
¿Alguna de las moléculas te resulta familiar? Por cierto, la poli(ADP-ribosa) es PAR, que también se mencionó en el artículo anterior.
Ahora estudiemos este artículo juntos.
La enfermedad de Parkinson y la alfa-sinucleína
La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa progresiva. Los pacientes presentan principalmente cuatro síntomas motores principales: temblor en reposo, bradicinesia, miotonía y trastorno postural de la marcha. Algunos se acompañan de síntomas no motores como ansiedad, depresión, trastornos del sueño, disfunción del sistema nervioso autónomo y deterioro cognitivo.
El principal cambio patológico de la enfermedad de Parkinson es la reducción de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra del mesencéfalo y la presencia de inclusiones eosinófilas en el citoplasma de las neuronas restantes, concretamente los cuerpos de Lewy. La αα-sinucleína fibrosa (α-syn) es el componente principal de los cuerpos de Lewy.
α-syn es una proteína presináptica ampliamente expresada en el cerebro y existe como un monómero proteico soluble en condiciones fisiológicas. Cuando se agrega en oligómeros fibrosos insolubles, es patógeno y puede provocar la muerte de las células neuronales. El α-syn patológico puede propagarse entre células como priones y promover la progresión de la EP.
Sin embargo, ¿qué causa la agregación patológica de α-syn? ¿Cómo conduce la agregación patológica de α-syn a la muerte celular? Nada de esto está claro.
PAR y PARP1
La poli ADP ribosa (PAR) es un producto sintetizado por la poli ADP ribosa polimerasa-1 (PARP-1) utilizando NAD+ como sustrato. La función principal de PARP-1 y PAR es detectar daños en el ADN causados por diversos motivos e iniciar el correspondiente mecanismo de reparación del ADN.
Muerte celular dependiente de PARP-1
La muerte celular dependiente de PARP-1 (Parthanatos) es un tipo de necrosis celular programada causada por la activación de PARP-1. Parthanatos lleva el nombre de PAR (el producto enzimático de PARP-1) + "thanatos (el dios griego de la muerte).
La muerte parcial es una forma de muerte celular que está ampliamente presente en enfermedades neurológicas y cardíacas. y otras enfermedades
Dado que PARP-1 y PAR en Parthanatos pueden causar la muerte celular, los autores pretenden explorar si PARP-1 y PAR están involucrados en la pérdida patológica de neuronas DA inducida por α-syn en la EP.
1?La neurotoxicidad de α-syn? PFF depende de PARP-1
Las fibrillas preformadas de α-syn (α-syn PFF) son α-syn recombinantes in vivo. forma fibras similares a α-syn y se propaga entre células neuronales como un prión. Cuando se inyecta en el cerebro del ratón, su sitio S129 se puede fosforilar para formar p-α-syn
Para explorar si α. -syn PFF puede activar PARP-1, las neuronas corticales primarias de rata se trataron con α-syn PFF y se usó WB para detectar los cambios en PAR. Los resultados mostraron que la expresión de PAR aumentó gradualmente desde el tercer día hasta el séptimo día. , hasta alcanzar el pico el día 14.
La tinción con PI mostró que el aumento de PAR iba acompañado del aumento de la muerte celular.
Las células se trataron con tres inhibidores de PARP (ABT-888, AG-014699, BMN 673) y se descubrió que podían prevenir la activación y la muerte celular inducida por α-syn PFF.
Las células tratadas con α-syn PFF pueden promover la fosforilación de α-syn en el sitio S129 para formar p-α-syn y promover la formación de α-syn soluble en agua en α-syn insoluble , los cuales son características de α-syn patológico. Los inhibidores de PARP pueden prevenir significativamente estos efectos.
La eliminación o eliminación de PARP-1 también puede prevenir significativamente la activación y apoptosis de PARP inducida por α-syn PFF.
La eliminación de PARP-1 puede prevenir la fosforilación de α-syn inducida por α-syn PFF y la formación de α-syn insoluble
El inhibidor de caspasas de amplio espectro Z-VAD puede parcialmente aliviar la toxicidad de α-syn PFF, el inhibidor de necroptosis Nec-1 y el inhibidor de autofagia 3-MA no pueden aliviar la muerte celular inducida por α-syn PFF, mientras que el inhibidor de PARP ABT-888 puede prevenir la muerte celular inducida por α-syn PFF , lo que indica que la muerte celular inducida por α-syn PFF depende principalmente de PARP-65438.
Los resultados experimentales anteriores muestran que eliminar PARP-1 o inhibir PARP-1 con fármacos puede reducir la formación de p-α-syn. ¿Podría esta disminución deberse a la reducción del PFF α-syn engullido por las células?
En condiciones de inhibición de fármacos y eliminación de PARP-1, se detectó el contenido de PFF α-syn marcado con biotina en endocitosis y no hubo diferencias significativas con respecto al grupo de control, lo que indica que PARP-1 no afectan la respuesta celular a la ingestión de α-syn -syn PFF.
Se mencionó en el fondo que α-syn PFF puede propagarse entre células como los priones y promover la progresión de la EP. ¿Sus propiedades de propagación de célula a célula también dependen de PARP-1?
El autor realizó experimentos en cámaras de microfluidos. Primero, se añadió α-syn PFF a la cámara 1 (C1) a través del dispositivo de microfluidos, y se detectó si α-syn apareció en la cámara 2 (C2) y en la cámara 3 (C3) el día 14, es decir, si α-syn PFF tiene una función de propagación.
Los resultados mostraron que p-α-syn podría detectarse en C2 y C3 14d en el grupo de neuronas WT, pero no en el grupo PARP-1 KO, lo que indica la función de propagación de α-syn PFF también dependiente de PARP-1.
2?α-syn PFF activa PARP-1 a través del daño en el ADN inducido por NO
La primera parte ha demostrado que α-cis PFF puede activar PARP-1 y activar PARP-1 a través de PARP-1 Para ejercer su neurotoxicidad, ¿cómo activa α-cis-PFF PARP-1?
Los autores descubrieron que tratar neuronas con α-syn PFF o inyectarlo directamente en el cerebro de ratones aumentaba los niveles de NO y daño en el ADN.
El tratamiento de células neuronales o de cerebro de ratón con el inhibidor de la NO sintasa L-NAME puede inhibir la síntesis de NO inducida por α-syn PFF, el daño al ADN y la activación de PARP-1.
Además, los inhibidores de la óxido nítrico sintasa también pueden inhibir la muerte celular inducida por α-PFF.
Estos resultados indican que α-syn PFF causa daño en el ADN al activar la NO sintasa, activando PARP-1 y provoca la muerte celular mediante oxidación parcial.
3?α-syn? PFF media la pérdida de neuronas de dopamina a través de PAR.
Los estudios han demostrado que α-syn PFF causa la muerte celular a través de parthanatos, entonces, ¿está relacionada esta vía con la pérdida de neuronas DA en la EP?
La inyección de α-syn PFF en el cuerpo estriado de ratones puede activar PARP-1 y aumentar los niveles de PAR. Eliminar PARP-1 o tratar con inhibidores de PARP-1 puede prevenir el aumento de los niveles de PAR causado por α-syn PFF y reducir la neurotoxicidad de α-syn PFF.
Al mismo tiempo, 6 meses después de la inyección de α-syn pff, el número de neuronas DA en el lado de la inyección de los ratones WT disminuyó aproximadamente un 50 %, mientras que el número de neuronas DA en el lado de la inyección PARP- 1 grupo knockout y grupo de tratamiento con inhibidor de PARP-1 La reducción no es obvia.
La tirosina hidroxilasa (TH) es la enzima clave para la síntesis de DA.
Los autores encontraron que el tratamiento de ratones WT con α-syn PFF redujo significativamente los niveles de transportadores de TH y DA (DAT), pero eliminar o inhibir PARP-1 evitó este fenómeno.
Además, los contenidos de DA y metabolitos de DA en el cuerpo estriado de ratones WT tratados con α-syn PFF se redujeron significativamente, mientras que no hubo cambios significativos en el grupo PARP-1 KO y PARP-1. grupo inhibidor.
La inyección intracerebral de α-syn PFF en ratones WT puede prolongar el tiempo de ascenso de la varilla y reducir la fuerza de agarre. Eliminar los inhibidores de PARP-1 o PARP-1 puede aliviar los síntomas motores de la EP causados por la PFF α-syn.
4?PAR promueve la fibrosis α-syn.
Estudios anteriores han demostrado que el PAR puede hacer que el líquido proteico desordenado inherente se estratifique y provoque su agregación. Entonces, ¿puede el PAR promover la agregación de α-syn?
Los autores observaron la formación de polímeros tras un período de incubación de monómeros α-syn con o sin PAR. Se encontró que los polímeros α-syn de diferentes pesos moleculares aparecieron después de 72 horas de incubación en ausencia de PAR, mientras que los polímeros α-syn de diferentes pesos moleculares aparecieron después de 24 horas de incubación en presencia de PAR.
Diferentes temperaturas de incubación o diferentes concentraciones de PAR conducirán a diferentes eficiencias de fibrosis de α-syn (Figura original S7A-C).
La T (fluorescencia de tioflavina T, ThT) se puede utilizar para controlar cualitativa y cuantitativamente el proceso de agregación de las fibrillas de amiloide. A través del monitoreo de fluorescencia ThT, se puede ver que PAR promueve significativamente la agregación α-syn.
La microscopía electrónica de transmisión observó que las fibras del oligómero α-syn aparecieron después de la incubación del monómero α-syn durante 72 horas sin PAR, mientras que los oligómeros α-syn se observaron después de la incubación durante 12 horas en presencia de PAR. formación de las cosas.
Dado que PAR es una molécula altamente cargada negativamente, para descartar que la agregación de α-syn causada por PAR se deba a la interacción de carga entre proteínas, los autores estudiaron la interacción de α-syn con el mismas moléculas PolyA cargadas negativamente -syn agregación, se encontró que no promovía significativamente la agregación α-syn.
Los experimentos de superposición muestran que existe una interacción entre PAR y α-syn, pero no hay interacción entre el monómero ADP ribosa (ADPr) y α-syn, lo que no afecta la agregación de α-syn.
PARP-1 puede promover la ribosilación de proteínas por ADP, entonces, ¿ribosilará α-syn?
El ensayo de ribosilación in vitro (IVRA) no mostró
El ensayo de superposición y el Co-IP sugirieron una interacción entre α-syn y PAR. Los autores confirmaron mediante análisis de eliminación y Co-IP que α-syn interactúa con PAR a través de su extremo amino.
Para explorar si la producción endógena de PAR puede promover la agregación de α-syn, se trataron neuronas corticales primarias de rata que expresan α-syn con ácido N-metil-D-aspártico (NMDA) y se descubrió que NMDA puede activar PARP. y causar agregación α-syn. Después de que PARP-1 fue eliminado o tratado con un inhibidor de PARP-1, la α-syn disminuyó.
La administración exógena de PAR rescató la agregación de α-Syn en células PARP-1 WT y PARP-1 KO que sobreexpresaban α-syn.
En el neuroblastoma SH-SY5Y, que sobreexpresa WT α-syn y α-syn A53T, la agregación de α-syn se puede promover mediante la administración del activador de PARP MNNG, pero eliminando PARP-1 o la administración de un inhibidor de PARP-1 puede reducir la agregación de α-syn, y PAR puede rescatarse de manera similar mediante suplementación exógena.
5? PAR mejora la toxicidad α-syn de PFF in vitro
Se ha demostrado que PAR se une a α-syn PFF, por lo que esta combinación cambiará las propiedades biofísicas de α. -sin PFF?
Los autores utilizaron K (proteinasa K) para digerir las células tratadas con α-syn PFF y PAR-α-syn PFF y descubrieron que las células tratadas con PAR-α-syn PFF eran más resistentes a la digestión por PK. , lo que sugiere que PAR-α-syn PFF puede plegarse más firmemente.
La primera parte ha demostrado que α-syn es neurotóxico. El autor repitió aproximadamente los experimentos de la primera parte, como que PAR promueve la muerte celular (figura original S10), promoviendo la producción de p-α-. syn, y promueve la producción de α-syn insoluble, promueve la endocitosis y difusión de α-syn (imagen original S11+)
6? PAR mejora la toxicidad de α-syn de PFF in vivo
> Para explorar el papel de PAR in vivo para el efecto de la toxicidad de α-syn PFF, los autores inyectaron α-syn PFF o PAR-α-syn PFF en el cuerpo estriado de ratones. Se descubrió que las neuronas DA-érgicas en el grupo de inyección de PAR-α-syn PFF se perdieron, p-α-syn se formó antes y el nivel de p-α-syn fue significativamente mayor que el del α-syn PFF. grupo de inyección.
Además, en comparación con α-syn PFF, PAR-α-syn PFF promovió significativamente la pérdida de DA y sus metabolitos (figura original S13) y disminuyó los niveles de th y DAT (figura original S14). El rendimiento de los ratones en la prueba de escalada de postes y en la prueba de fuerza de agarre se deterioró.
7? Aumento de los niveles de PAR en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con enfermedad de Parkinson
Los autores probaron los niveles de PAR en el líquido cefalorraquídeo de dos cohortes independientes de pacientes con EP y controles y encontraron que el Los niveles de PAR en líquido de los pacientes con EP fueron significativamente más elevados, y los niveles de PAR están relacionados con el curso de la enfermedad y se correlacionan positivamente con la estadificación de Hoehn y Yahr.
Además, los autores encontraron que los niveles de PAR en la sustancia negra (SN) de pacientes con EP también estaban significativamente elevados, lo que era consistente con resultados de investigaciones anteriores.
El α-syn patológico induce daño en el ADN y PARP-1 al activar la NO sintasa, y el PAR producido promueve la producción de α-syn patológico y provoca la muerte celular a través de parthanatos. Eliminar o reducir PARP-1 puede inhibir la toxicidad patológica de α-syn. PAR puede mejorar la toxicidad de la α-syn patológica tanto in vivo como in vitro, y formar un circuito de retroalimentación. El contenido de PAR en el líquido cefalorraquídeo y el lodo de los pacientes con EP está significativamente elevado. Estos resultados indican que la activación de PARP-1 está implicada en la progresión de la EP y, por lo tanto, se espera que la inhibición de la activación de PARP-1 prevenga la pérdida progresiva de neuronas DA en la EP.
Esta imagen es la historia completa.
La rutina de este artículo se muestra en la siguiente figura.
Espero que este artículo pueda inspirarte.
Referencia
[1] La poli(ADP-ribosa) impulsa la neurodegeneración patológica de la α-sinucleína en la enfermedad de Parkinson[J Science (Nueva York, NY), 2018, 362(6414). ).
[2]? et al. Efectos de las enzimas tumorales en la enfermedad de Parkinson [J Science (Nueva York, NY), 2018, 362(6414): 521-522.