Principios experimentales, métodos y precauciones para la tinción HE

La tinción HE, cuyo nombre completo es tinción con hematoxilina y eosina, es la técnica de tinción patológica más básica e importante.

La tinción HE es un método de tinción convencional ampliamente utilizado en el diagnóstico patológico en el país y en el extranjero. Un buen corte HE es la clave para asegurar un correcto diagnóstico patológico. La calidad de los cortes puede afectar directamente la puntualidad y precisión del diagnóstico de la enfermedad. Como técnico experimental calificado, ser capaz de producir una sección teñida con HE de alta calidad es una lección importante que debe dominar.

Principios experimentales y precauciones de la tinción HE

1. Principio de la tinción nuclear:

La hematoxilina es un tinte natural alcalino que puede colorear el núcleo. El componente principal de la cromatina en el núcleo celular es el ADN. En la estructura de doble hélice del ADN, los grupos fosfato en las dos cadenas de nucleótidos miran hacia afuera, lo que hace que el exterior de la doble hélice del ADN tenga carga negativa y sea ácido, y pueda interactuar fácilmente con el ADN. los cargados positivamente. El combustible alcalino de hematoxilina se tiñe mediante enlaces iónicos o de hidrógeno. La hematoxilina aparece azul en solución alcalina, por lo que los núcleos celulares se tiñen de azul.

2. Principio de la tinción del citoplasma:

El componente principal del citoplasma es la proteína, que es un compuesto anfótero. La tinción del citoplasma está estrechamente relacionada con el valor del pH. el pH se ajusta a las proteínas, etc. Cuando el punto eléctrico es 4,7-5,0, el citoplasma no muestra electricidad al exterior. En este momento, los tintes ácidos o básicos no son fáciles de teñir. Cuando el pH se ajusta a 6,7-6,8, el valor del pH es mayor que el punto isoeléctrico de la proteína, lo que indica ionización ácida, y los aniones cargados negativamente pueden teñirse con tintes cargados positivamente. Ahora el núcleo también se tiñe y el núcleo. y el citoplasma son difíciles de distinguir. Por lo tanto, el pH debe ajustarse por debajo del punto isoeléctrico del citoplasma y se agrega ácido acético a la solución de tinte para hacer que el citoplasma esté cargado positivamente (catiónico), de modo que pueda teñirse con tintes cargados negativamente (aniónicos). La eosina Y es un tinte ácido sintetizado químicamente que se disocia en aniones cargados negativamente en agua y se combina con las cargas amino positivas (cationes) de las proteínas para teñir el citoplasma, los glóbulos rojos, los músculos, los tejidos conectivos y las partículas rojas de eosinófilos, etc. están infectadas en diversos grados de rojo o rosa, lo que contrasta marcadamente con los núcleos de las células azules.

3. Diferenciación:

Después de la tinción, se utilizan determinadas soluciones específicas para eliminar el exceso de tinte adherido al tejido. Este proceso se denomina diferenciación, y la solución utilizada se denomina líquido de diferenciación. . En la tinción HE, se utiliza etanol de ácido clorhídrico 0,5 como solución de diferenciación, porque el ácido puede destruir la estructura de quinona de la hematoxilina, lo que hace que el tejido se separe del pigmento y se desvanezca. Después de la tinción con hematoxilina, se debe diferenciar con etanol de ácido clorhídrico al 0,5 para eliminar el tinte de hematoxilina excesivamente unido al núcleo y el tinte de hematoxilina adsorbido en el citoplasma. Solo realizando la tinción con eosina se puede garantizar la consistencia de la tinción del núcleo y el citoplasma. . distinto. Por lo tanto, la diferenciación en la tinción HE es un paso extremadamente crítico.

4. Efecto de retorno de azul:

Después de la diferenciación, la hematoxilina está en estado de ion rojo en condiciones ácidas y aparece roja en condiciones alcalinas, está en estado de ion azul y aparece; rojo. Las secciones de tejido aparecerán de color rojo o rosado después de diferenciarlas con 0,5 de ácido clorhídrico y etanol. Por lo tanto, después de la diferenciación, elimine inmediatamente el ácido de las secciones de tejido con agua para terminar la diferenciación y luego use agua alcalina débil (0,2 de agua con amoníaco) para producir la hematoxilina. -los núcleos celulares teñidos aparecen de color azul, este proceso se llama azulado o azulado. Además, remojar con agua del grifo también puede hacer que el núcleo celular vuelva a ponerse azul, pero lleva más tiempo.

Materiales experimentales

Solución fija: etanol 95 de uso común y acetona glacial

Colorante de hematoxilina: pesar 0,5g de hematoxilina en polvo y 24g de vitriolo de amonio Disolver en 70ml de agua destilada, luego tomar 31g de NaIO y 5ml de agua, luego agregar 30ml de glicerina y 2ml de ácido acético glacial, mezclar uniformemente, filtrar con papel de filtro y reservar.

Colorante de eosina: Pesar 0,5g de colorante de eosina hidrosoluble y disolverlo en 100ml de agua destilada.

Solución diluida de ácido clorhídrico en etanol: Preparar 1 ácido clorhídrico con 75 de etanol.

Concentraciones seriadas de etanol, xileno y goma neutra.

Botelles de cultivo, placas de petri, pinzas oftálmicas, cubreobjetos, portaobjetos, microscopios.

Pasos experimentales

Preparación de la muestra: para las células de crecimiento adherentes, digerirlas con tripsina, ajustar la concentración celular a aproximadamente 1×105/ml y dejar caer sobre el cubreobjetos (colocado en Placa de 6 pocillos), después de cultivar durante un período de tiempo correspondiente, retirar las células, extenderlas y lavarlas tres veces con PBS.

Fijación de la muestra: fijada con etanol al 95% durante 20 min, lavada dos veces con PBS, 1 min cada vez.

Teñir los núcleos: teñir con colorante de hematoxilina durante 2-3 minutos y lavar con agua del grifo.

Separación de colores: observar al microscopio si los núcleos celulares están teñidos de forma demasiado oscura, utilizar 1 solución de alcohol de ácido clorhídrico para la separación de colores durante unos segundos y lavar con agua del grifo.

Para teñir el citoplasma: sumergir en solución de tinción de eosina durante 1 minuto y lavar con agua del grifo.

Secar las células con secador o de forma natural. Después de subir al portaobjetos, sellar el portaobjetos con goma neutra.

Si las células se fijan con 4-paraformaldehído, el tiempo de tinción se ampliará en consecuencia, 12-15 minutos para la tinción con hematoxilina y 5 minutos para la eosina.

Resultados experimentales y precauciones

**Resultados experimentales**

El núcleo celular es de color azul, y el citoplasma, las fibras musculares, las fibras de colágeno y los glóbulos rojos. son rojos en diversos grados. Las sales de calcio y las bacterias pueden ser de color azul o azul violeta.

Notas:

1. Es importante ajustar el valor del pH al teñir. Si el bloque de tejido se fija en formalina durante mucho tiempo, el tejido se acidificará y afectará la tinción del núcleo. Por lo tanto, las células deben enjuagarse con agua del grifo durante más tiempo o tratarse en una solución acuosa saturada de carbonato de litio durante 10 a 30 minutos, lo que puede oscurecer los núcleos celulares. Si el citoplasma no se tiñe bien cuando se tiñe con eosina, se pueden agregar 1-2 gotas de ácido acético glacial a la solución de eosina.

2. Después de teñir las secciones con hematoxilina, el paso de separación de colores es crítico y debe controlarse bajo un microscopio. Generalmente, es mejor si los núcleos están claramente teñidos (claros) y el citoplasma es básicamente. incoloro. Si el tiempo de separación del color se extiende demasiado, el teñido será demasiado claro y el color deberá volver a teñirse antes de la separación del color.

3. Después de deshidratar las rodajas con alcohol, puede aparecer un estado blanco opaco cuando se colocan en xileno. Esto indica una deshidratación incompleta. Las rodajas deben devolverse al alcohol anhidro y reemplazarse con alcohol y xileno para poder secarlas. Consigue una deshidratación completa y una deshidratación transparente.