Nuevas Tecnologías para el Análisis de Vesículas Extracelulares

Enlace original: Huilin Shao, Hyungsoon Im, Cesar M. Castro, Xandra Breakefield, Ralph Weissleder y Hakho Lee Nuevas tecnologías para el análisis de vesículas extracelulares Rev. 28 de febrero de 2018;118(4): 1917-1950. doi: 10.1021/acs.chemrev.7b00534.

Esta revisión fue publicada en Chemical Reviews, con un factor de impacto de 54.301 puntos. Es un resumen muy completo de los métodos de investigación sobre vesículas extracelulares. Básicamente, los métodos de investigación que se utilizan actualmente en la investigación de vehículos eléctricos se presentan en esta revisión, que es muy detallada. El autor correspondiente es el profesor Hakho Lee de la Universidad de Harvard.

Vesículas extracelulares (EV) Las vesículas extracelulares son diversas vesículas de membrana a nanoescala liberadas activamente por las células. Las vesículas de tamaño similar se pueden clasificar además según su biogénesis, tamaño y propiedades biofísicas (p. ej., exosomas, microvesículas). Aunque inicialmente se consideraba que los vehículos eléctricos eran desechos celulares y, por lo tanto, se subestimaban, ahora se los reconoce cada vez más como importantes portadores de comunicación entre células y biomarcadores circulantes para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades.

El contenido de esta revisión incluye:

Los fluidos biológicos (Biofluidos) contienen una gran cantidad de EV, que pueden transferir diferentes moléculas de las células parentales a otras células, incluyendo: proteínas, ARNm. /miARN, ADN, etc.

La formación de EV determina la composición de su membrana.

La composición de la membrana de las microvesículas refleja mejor la membrana plasmática de sus Células Parenteras.

Por el contrario, en los exosomas se han identificado moléculas proteicas endosómicas específicas, lo que refleja el mecanismo de formación de los exosomas. Se ha reconocido ampliamente que el complejo de clasificación endosómica (ESCRT) regula y guía moléculas específicas hacia las vesículas luminales de los MVB. ESCRT y sus cuatro complejos principales (ESCRT 0, I, II y III) son responsables de entregar proteínas ubiquitinadas para la degradación lisosomal y el reciclaje de proteínas. Estudios recientes han demostrado que el agotamiento de proteínas específicas de la familia ESCRT puede alterar el contenido proteico de los exosomas y la velocidad a la que las células liberan exosomas. Más interesante aún, se descubrió que los exosomas son ricos en componentes del sistema ESCRT (como TSG101 y Alix), que pueden usarse como marcadores para el reconocimiento de exosomas.

La ESCRT no es el único mecanismo que media en la formación de exosomas. Otros procesos independientes de ESCRT parecen estar involucrados en su formación y secreción de manera entrelazada. Los exosomas también son ricos en moléculas independientes de ESCRT. Por ejemplo, se ha demostrado que las tetraspaninas CD9, CD63 y CD81 están implicadas en el tráfico de vesículas endosómicas. La participación de la familia Rab de pequeñas GTPasas en el tráfico de vesículas y la fusión con la membrana plasmática sugiere un papel de estas proteínas en la liberación de exosomas. Además, los niveles de ceramida en los exosomas aumentan y la inhibición de la esfingomielina provoca una disminución en la liberación de exosomas, lo que indica que la esfingomielinasa está relacionada con la liberación de vesículas.

Tanto los exosomas como las microvesículas contienen ácidos nucleicos, entre ellos miARN, ARNm, ADN y otros ARN no codificantes.

Desde el descubrimiento inicial de que los vehículos eléctricos contienen ARN, ha habido un interés considerable en el uso del ARN de los vehículos eléctricos como biomarcadores de diagnóstico. En un trabajo fundamental, Skog et al. descubrieron que los exosomas séricos de pacientes con glioblastoma contienen ARNm mutante característico (ARNm de EGFRvIII) y miARN, que pueden usarse para proporcionar información de diagnóstico. El descubrimiento de estos ácidos nucleicos llevó a la hipótesis de que los vehículos eléctricos pueden transferir información genética entre células. De hecho, Varady et al. y Skog et al. demostraron que los vehículos eléctricos contienen ARNm que aún se puede traducir después de la transferencia a las células huésped. Los retrotransposones y otros ARN no codificantes también se expresan en los vehículos eléctricos. Las secuencias de retrotransposones y los miARN, así como los ARNm traducibles, se transfieren a través de los vehículos eléctricos. Estos resultados resaltan la importancia de los vehículos eléctricos como portadores y diseminadores de información genética.

Aunque el límite de difracción de los microscopios ópticos tradicionales es cercano al tamaño del EV, no puede producir imágenes claras. Las imágenes de vehículos eléctricos de alta resolución deben obtenerse mediante microscopía electrónica (EM) o microscopía de fuerza atómica (AFM). Sin embargo, estos métodos tienen un rendimiento limitado porque se requieren protocolos y equipos de tinción especializados.

(a) El microscopio electrónico de barrido (SEM) proporciona información topológica de superficies tridimensionales.

(b) La microscopía electrónica de transmisión (TEM) tiene una excelente resolución de imagen y se puede utilizar junto con el marcaje con inmunooro para proporcionar una caracterización molecular.

(c) La microscopía crioelectrónica (crio-EM) puede analizar la morfología de los vehículos eléctricos sin un procesamiento extenso.

La dispersión dinámica de la luz (DLS), también conocida como espectroscopia de correlación de fotones o dispersión de luz cuasi elástica, es un método de caracterización física que se utiliza para medir la distribución del tamaño de partículas en soluciones o suspensiones. Comportamiento de fluidos complejos como soluciones concentradas de polímeros. Cuando la luz incide en partículas pequeñas que son mucho más pequeñas que su longitud de onda, la luz se dispersa en todas direcciones (dispersión de Rayleigh). Si la fuente de luz es un láser, en una determinada dirección, podemos observar que la intensidad de la luz dispersada fluctúa con el tiempo. Esto se debe a que las pequeñas partículas en la solución realizan un movimiento browniano y la distancia entre cada partícula dispersada siempre cambia. con el tiempo. La luz dispersada por diferentes partículas interfiere de forma constructiva o destructiva debido a diferencias de fase. La curva resultante de fluctuaciones de intensidad a lo largo del tiempo contiene información sobre el movimiento de las partículas en dispersión a lo largo del tiempo. Los experimentos de dispersión dinámica de la luz se ven fácilmente afectados por el polvo o las impurezas, por lo que la filtración y centrifugación de las muestras son muy importantes.

La dispersión dinámica de la luz se utiliza para caracterizar el tamaño de proteínas, polímeros, micelas, azúcares y nanopartículas. Si el sistema es monodisperso, se puede encontrar el diámetro efectivo medio de las partículas. Esta medida depende del núcleo de la partícula, la estructura de la superficie, la concentración de partículas y las especies iónicas en el medio. DLS también se puede utilizar para estudios de estabilidad. Al medir la distribución del tamaño de las partículas en diferentes momentos, puede mostrar la tendencia de las partículas a agregarse con el tiempo. A medida que las partículas se aglomeran, las partículas con tamaños de partícula más grandes se vuelven más numerosas. Asimismo, DLS también se puede utilizar para analizar el efecto de la temperatura sobre la estabilidad.

La dispersión dinámica de la luz recoge las fluctuaciones en la intensidad de la luz dispersadas por las partículas que experimentan movimiento browniano en una solución. Las fluctuaciones en la intensidad de la luz se convierten en curvas de correlación a través de un correlacionador, obteniendo así la velocidad de las fluctuaciones de la intensidad de la luz y calculándola. las partículas. información sobre la velocidad de difusión y el tamaño de las partículas. El movimiento browniano de muestras de partículas pequeñas es rápido, la intensidad de la luz fluctúa rápidamente y la curva de correlación se atenúa rápidamente, mientras que ocurre lo contrario con las partículas grandes.

En la investigación de exosomas, la medición de la dispersión dinámica de la luz es muy sensible, con un límite de medición inferior de 10 nanómetros. En comparación con la tecnología SEM, la preparación de muestras es sencilla, solo se requiere una filtración sencilla y la velocidad de medición es más rápida. Sin embargo, dado que la tecnología de dispersión dinámica de la luz mide los datos de fluctuación de la intensidad de la luz, la señal de fluctuación de la intensidad de la luz de partículas grandes cubrirá la señal de fluctuación de la intensidad de la luz de partículas más pequeñas, por lo que la dispersión dinámica de la luz no es adecuada para la medición de muestras complejas de exosomas de diferentes tamaños. , solo es adecuado para medir el tamaño de exosomas de tamaño uniforme preparados mediante cromatografía y no puede medir la concentración de exosomas en la muestra.

El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) es un método de seguimiento óptico de partículas que se utiliza para determinar la concentración y la distribución del tamaño de las partículas. Se irradia un haz de luz sobre las partículas de la muestra. A medida que las partículas dispersan la luz y experimentan un movimiento browniano, la cámara registra la trayectoria de cada partícula para determinar la velocidad promedio y la tasa de difusión. A diferencia de las mediciones de dispersión masiva de DLS, NTA rastrea la dispersión de partículas individuales.

Esta información se utiliza luego para calcular matemáticamente la concentración (es decir, el número de partículas en el campo de visión) y la distribución de tamaño (es decir, el diámetro hidrodinámico mediante la ecuación de Strokes-Einstein, Figura 5b). Para cuantificar con precisión la concentración y el tamaño de vesículas heterogéneas, el procedimiento NTA requiere una optimización precisa de la configuración de la cámara y el análisis. Es posible que se requieran mediciones individuales utilizando diferentes configuraciones para obtener lecturas precisas de subconjuntos de vehículos eléctricos en mezclas heterogéneas.

Los EV son heterogéneos en tamaño, origen y composición molecular; además, están presentes en diferentes fluidos biológicos complejos, entre ellos sangre, derrame pleural, ascitis y leche materna, saliva, líquido cefalorraquídeo y orina. Estos fluidos también contienen grandes cantidades de estructuras macromoleculares no vesiculares que pueden interferir con el análisis de EV. Por tanto, la separación y el enriquecimiento de los vehículos eléctricos es particularmente importante.

La ultracentrifugación (80) y la centrifugación en gradiente de densidad (20) son los dos métodos de separación por mezcla de alto rendimiento más comunes. Según sus mecanismos de separación, estos métodos se pueden dividir en tres categorías amplias: densidad, afinidad y tamaño.

Se utilizaron diferentes fuerzas centrífugas para separar las partículas: se utilizó una fuerza centrífuga más baja (300 g) para eliminar los restos celulares, mientras que una fuerza centrífuga más alta (100.000 g) se utilizó para sedimentar y concentrar los vehículos eléctricos. Aunque este método es el estándar de oro más utilizado, también tiene muchas desventajas, como gran volumen, instrumentación costosa, tiempo de procesamiento prolongado, proceso engorroso, contaminación por proteínas agregadas y partículas de nucleoproteínas y la necesidad de grandes cantidades de muestras.

La centrifugación en gradiente de sacarosa es un método de ultracentrifugación más estricto, que ayuda a separar aún más vesículas de diferentes densidades y generalmente se usa para aislar exosomas (la densidad de la suspensión es de 1,15 a 1,19 g/mL). En este método, se coloca una muestra que contiene vesículas y macromoléculas de diferentes tamaños sobre una superficie de gradiente con una densidad creciente de arriba a abajo. Durante la centrifugación, se depositan diferentes moléculas a través del gradiente a diferentes velocidades. Debido a su mayor resolución, se cree que este método permite el aislamiento de vehículos eléctricos de mayor pureza (particularmente exosomas); sin embargo, enfrenta muchas limitaciones asociadas con la ultracentrifugación; Se considera que los métodos más nuevos de gradiente isotónico (como el gradiente de yodoflavina) son más eficaces.

Recientemente, se han desarrollado kits comerciales basados ​​en métodos de precipitación de ADN polimérico (p. ej., ExoQuick, Exo-Spin) para el enriquecimiento de vehículos eléctricos. Estos reactivos funcionan reduciendo la hidratación (y por lo tanto la solubilidad) de los vehículos eléctricos, lo que conduce a la precipitación, y los productos de vehículos eléctricos precipitados se pueden aislar de manera fácil y reproducible con fuerzas de centrifugación bajas, evitando así la necesidad de largos procedimientos de ultracentrifugación. Sin embargo, estos kits son caros para su uso a gran escala y carecen de especificidad para los vehículos eléctricos. Este método también tiende a producir partículas poliméricas heterogéneas. Dado que todos estos reactivos reducen la solubilidad de los vehículos eléctricos y las proteínas, este método también permite la precipitación precisa de lipoproteínas y complejos de ARN Ago-2. Por lo tanto, el método de precipitación *** está limitado como método de aislamiento de EV.

La cromatografía de exclusión por tamaño separa vesículas y otras moléculas en función de su tamaño molecular mediante filtración en gel. Este gel consta de perlas esféricas que contienen poros con una distribución de tamaño específica. A medida que la muestra ingresa al gel, las moléculas pequeñas se difunden hacia los poros, mientras que las moléculas más grandes eluyen directamente.

Por lo tanto, las moléculas grandes abandonan la columna antes que las moléculas pequeñas, lo que permite correlacionar el tiempo de residencia de las moléculas con el tamaño de la columna. En los últimos años, este método de separación se ha aplicado al aislamiento y purificación de vesículas a partir de medios biológicos complejos. Empresas comerciales como Sepharose, GE Healthcare; qEV, iZon, etc. también están desarrollando productos comerciales para simplificar el enriquecimiento de EV. Las columnas de exclusión de estos productos son todas resinas con un tamaño de poro de aproximadamente 75 nanómetros. Las proteínas y otras moléculas contaminantes más pequeñas quedan atrapadas en los poros, mientras que las vesículas más grandes (gt; 75 nm) pueden pasar rápidamente y eluir en los huecos. El método de exclusión por tamaño puede separar los EV de las proteínas solubles para mejorar la eficiencia y la resolución de la separación, es necesario considerar muchos factores, incluido el tipo de medio, el tamaño de los poros, la interacción entre los EV y los medios, el tamaño de la columna, el embalaje de la columna y el caudal; etc.

Para mejorar la eficiencia y la especificidad del aislamiento de vehículos eléctricos a partir de fluidos biológicos complejos, se han desarrollado una variedad de nuevos métodos de enriquecimiento de vehículos eléctricos. Sin embargo, la mayoría de estos nuevos métodos tienen tasas de rendimiento más bajas en comparación con los métodos tradicionales, lo que debe abordarse para hacerlos prácticos.

La separación basada en el tamaño molecular es un método prometedor para separar los vehículos eléctricos de los restos celulares de gran tamaño. Se han desarrollado varios sistemas de filtración de microfluidos para separar los vehículos eléctricos de los restos de células grandes y los agregados de proteínas, la mayoría de los cuales se basan en diferencias de tamaño molecular. Por ejemplo, Rho et al. construyeron un dispositivo de microfluidos que utilizaba filtros de membrana para examinar muestras de sangre no procesadas y aislar vehículos eléctricos. ¿Tamaño del filtro de membrana? Se inserta un tubo capilar debajo de la membrana para guiar los vehículos eléctricos filtrados hacia el canal de recolección. El filtro de membrana y la guía capilar están intercalados entre dos anillos magnéticos; esta configuración permite una fácil sustitución del conjunto de filtros al procesar grandes volúmenes de muestras.

Lee et al. utilizaron recientemente ondas sonoras para segmentar vehículos eléctricos sin contacto. Esta separación utiliza ondas estacionarias ultrasónicas que ejercen diferentes fuerzas de interacción acústica sobre las vesículas según su tamaño y densidad. El dispositivo consta de un par de electrodos transductores entrelazados (IDT) para generar ondas acústicas de superficie estacionaria a través de un canal de flujo.

Las proteínas EV se derivan principalmente de la membrana citoplasmática y del alcohol citoplasmático, más que de otros orgánulos intracelulares (como el aparato de Golgi, el retículo endoplásmico, el núcleo, etc.). La composición de las proteínas EV sugiere biogénesis de vesículas y clasificación de carga (esta traducción es un poco extraña). Por lo tanto, la Organización Internacional de Vesículas Extracelulares recomienda que las proteínas EV, especialmente las proteínas transmembrana y las proteínas citoplasmáticas, se identifiquen cuidadosamente.

En los mamíferos, tanto las proteínas transmembrana como las proteínas extracelulares unidas a lípidos (como los endosomas) están asociadas a microvesículas y exosomas. Las proteínas transmembrana de los exosomas son ricas en proteínas tetraméricas (como CD9, CD63 y CD81), una superfamilia de proteínas con cuatro dominios transmembrana. Las proteínas tetraméricas participan en el transporte de la membrana celular y la maduración biosintética y se expresan altamente en los exosomas. Esta característica hace que las proteínas tetraméricas se utilicen para la cuantificación y caracterización de exosomas. Sin embargo, es importante señalar que las proteínas tetraméricas no se expresan exclusivamente en exosomas. Por otro lado, las microvesículas son ricas en integrinas, selectinas y ligandos CD40, lo que indica que derivan de la membrana plasmática de las células, y las EV son ricas en receptores de proteínas transmembrana específicos (como los receptores del factor de crecimiento epidérmico/EGFR) y proteínas de adhesión. (como la molécula de adhesión de células epiteliales/EpCAM). Dado que muchas proteínas transmembrana están involucradas en la fisiología normal y la patogénesis de la enfermedad, se utilizan como importantes biomarcadores fisiopatológicos de EV.

Las proteínas intravesiculares relacionadas con los EV tienen múltiples funciones.

Incluyen proteínas citoplasmáticas con capacidades de unión a membranas o receptores que participan en el tráfico de vesículas, como TSG101, ALIX, anexinas y Rabs. Los vehículos eléctricos también son ricos en proteínas citoesqueléticas (como lactonas, miosinas y tubulinas), chaperonas moleculares (como proteínas de choque térmico/HSP), enzimas metabólicas (como enolasa, enzima deshidrogenación de gliceraldehído 3-fosfato/GAPDH y proteínas ribosómicas). Curiosamente, estudios recientes han encontrado que las células receptoras pueden transportar y recibir proteínas EV de manera eficiente, provocando así fuertes respuestas celulares in vivo e in vitro. Esto brinda nuevas oportunidades para los vehículos eléctricos como portadores terapéuticos y de fármacos.

La cuantificación y caracterización de las proteínas EV no solo es importante para dilucidar la biogénesis y la clasificación de carga de los EV, sino también para identificar marcadores fisiológicos y patológicos. Sin embargo, los análisis de proteínas tradicionales, incluidas la transferencia Western y los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), a menudo requieren grandes volúmenes de muestra, un procesamiento extenso y/o instrumentos especializados voluminosos, lo que los hace menos adecuados para aplicaciones clínicas.

A la hora de evaluar proteínas EV, la transferencia Western es probablemente la técnica más utilizada para indicar la presencia de proteínas diana relacionadas con EV. En este proceso, las preparaciones de vesículas purificadas (generalmente preparadas mediante el método de ultracentrifugación en gradiente estándar de oro) se pueden tratar con tampón de lisis tamponado que contiene desnaturalizantes e inhibidores de proteasa. Luego, los lisados ​​​​de proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), se transfirieron a una membrana y se sometieron a inmunotransferencia para dianas proteicas específicas. Aunque este método tiene largos tiempos de preparación y procesamiento (gt; 10 h), la transferencia Western puede proporcionar información útil sobre el tamaño molecular de las proteínas.

A diferencia de la transferencia Western, ELISA solo puede cuantificar proteínas diana dentro de un rango relativamente pequeño, y la espectrometría de masas puede lograr un análisis de mapeo de péptidos de alto rendimiento. Las preparaciones de EV purificadas se someten a digestión enzimática y aislamiento de péptidos, seguido de análisis de ionización por espectrometría de masas. En este complejo proceso, varios pasos afectan gravemente el análisis proteómico de los vehículos eléctricos. Además de la purificación eficiente de EV, el fraccionamiento de péptidos antes del análisis de espectrometría de masas se considera un requisito previo importante para la identificación de proteínas de vesículas. Por lo general, se logra mediante tres métodos principales: (1) SDS-PAGE, (2) cromatografía líquida bidimensional y (3) fraccionamiento basado en enfoque isoeléctrico.

Es importante señalar que, dado que la espectrometría de masas puede identificar fragmentos de péptidos digeridos, es necesaria una identificación, cuantificación y validación adecuadas de las proteínas. Ya existen dos enfoques técnicos para la cuantificación: basado en etiquetas y sin etiquetas. En el análisis cuantitativo basado en etiquetas, las etiquetas (isobáricas o isotópicas) se utilizan para el análisis comparativo. Para el análisis cuantitativo sin etiquetas, se aplica el recuento espectral de intensidades cromatográficas. Las proteínas candidatas identificadas se pueden verificar utilizando otras técnicas de proteínas tradicionales, como la transferencia Western. En términos de sensibilidad de detección, la espectrometría de masas es generalmente menos sensible que las técnicas basadas en anticuerpos.

Aunque el análisis de espectrometría de masas requiere un amplio tiempo de preparación y procesamiento (días), puede proporcionar un análisis de proteoma comparativo de EV, cuantitativo y de alto rendimiento. Hasta la fecha, se han clasificado sistemáticamente miles de proteínas vesiculares y se han analizado las interacciones proteína-proteína. En varias revisiones se ha destacado una discusión detallada del análisis proteómico basado en espectrometría de masas de vehículos eléctricos de mamíferos y bacterias. El estudio de estas redes e interacciones ayuda a dilucidar las actividades funcionales de los vectores EV y su importante papel en la comunicación a larga distancia entre células.

Para abordar los desafíos técnicos asociados con la cuantificación de proteínas EV, se está desarrollando una nueva generación de biosensores. En comparación con los métodos tradicionales de detección de proteínas, estos biosensores utilizan mecanismos de detección únicos y pueden detectar vehículos eléctricos de diversos tamaños y contenidos moleculares. Muchas de estas técnicas requieren muestras más pequeñas y menos manipulación, lo que las hace muy adecuadas para aplicaciones médicas.

La citometría de flujo es una poderosa técnica para clasificar partículas individuales grandes (como células o entidades de tamaño micrométrico) basándose en la dispersión de la luz y la activación de la fluorescencia. Sin embargo, la citometría de flujo tradicional tiene capacidades limitadas de detección de partículas pequeñas. Los 500 nm de diámetro tienen una sensibilidad y resolución limitadas. Además, sufre de un fondo óptico elevado debido a la presencia de partículas pequeñas (aproximadamente 200 nm) en el fluido de la envoltura. Al cuantificar los vehículos eléctricos mediante citometría de flujo tradicional, es posible que se pasen por alto o se subestimen un gran número de vehículos eléctricos pequeños: se pueden iluminar varias vesículas pequeñas al mismo tiempo y contarlas como un solo evento, un fenómeno conocido como teoría de la "población".

Para abordar los inconvenientes de la citometría de flujo tradicional, se utilizan perlas de látex del tamaño de una micra para unir múltiples vesículas. Luego, los vehículos eléctricos unidos se tiñen con anticuerpos fluorescentes y se identifican sus marcadores proteicos. Sin embargo, este método carece de la capacidad de analizar vesículas individuales y no puede diferenciar entre diferentes subpoblaciones de vesículas, lo que puede provocar la pérdida de características.

La tecnología se basa principalmente en nanopartículas magnéticas (MNPs). Dado que la mayoría de los materiales biológicos carecen naturalmente de un fondo ferromagnético, esta detección es prácticamente inmune a la interferencia de otras muestras biológicas en el mismo sistema. Por lo tanto, incluso las muestras ópticamente turbias son transparentes a los campos magnéticos; cuando las moléculas objetivo son objetivo de MNP específicas, contrastan fuertemente con el fondo biológico natural. En la detección magnética basada en resonancia magnética nuclear (RMN), las MNP se colocan en el campo magnético de RMN para generar un campo magnético local, cambiar la tasa de relajación lateral de las moléculas de agua circundantes y amplificar la señal de análisis. Como resultado, la RMN reduce la manipulación de muestras, aumenta la sensibilidad de detección y se ha desarrollado para múltiples aplicaciones en el lugar de atención (por ejemplo, detección de células tumorales y bacterias circulantes directamente a partir de muestras de sangre).

Sin embargo, la aplicación de esta tecnología a la detección de vehículos eléctricos ha encontrado desafíos, porque los vehículos eléctricos son obviamente de 1 a 2 órdenes de magnitud más pequeños que las células tumorales. Shao et al. desarrollaron una nueva tecnología analítica específicamente para la detección de vehículos eléctricos y el análisis de proteínas. Este método utiliza un enfoque de química de clic bioortogonal de dos pasos para etiquetar los vehículos eléctricos. Esta estrategia de etiquetado de moléculas pequeñas (lt; 200 Da) no aumenta significativamente el tamaño de los anticuerpos o las MNP, lo que mejora la retención de las vesículas objetivo de los anticuerpos no unidos y las MNP. eficiencia. La abundancia de biomarcadores de vehículos eléctricos se determinó midiendo directamente los vehículos eléctricos mediante resonancia magnética micronuclear (μNMR) en un chip de microfluidos.

En comparación con la tecnología de proteínas tradicional, el sistema μNMR muestra una mejor sensibilidad de detección: 10 3 veces más sensible que WB y ELASA. Shao et al. utilizaron esta tecnología integrada para estudiar vehículos eléctricos en líneas celulares de glioblastoma multiforme (GBM) cultivadas en placas de cultivo. El análisis comparativo de proteínas confirmó que los vehículos eléctricos efectivamente reflejan el perfil proteico de sus células parentales, y que la combinación de cuatro marcadores de GBM (EGFR, EGFRvIII, PDPN e IDH1

R132H) se puede utilizar para distinguir los vehículos eléctricos derivados del cáncer de los los vehículos eléctricos derivados de células anfitrionas.

En vista del pequeño tamaño de los vehículos eléctricos, se propuso una nueva solución rápida de detección de vehículos eléctricos sin etiquetas: la vibración del plasmón superficial (SPR). SPR se refiere a la oscilación colectiva de los electrones de conducción en la interfaz metal-dieléctrico bajo irradiación de luz incidente. A diferencia de otros métodos de detección óptica basados ​​en sondas de fluorescencia y quimioluminiscencia sensibles al tiempo, la detección SPR detecta cambios locales en el índice de refracción relacionados con la unión de biomoléculas cerca de la interfaz metal-dieléctrico y se puede aplicar a la detección sin etiquetas y en tiempo real.

El ARN es el principal ácido nucleico transportado por los vehículos eléctricos. En comparación con el ARN de las células, el ARN transportado por los eEV es generalmente más corto (normalmente <200 nucleótidos, pero también hasta 5 kb). Son principalmente ARN no codificantes, incluidos microARN (miARN), ARNt (ARNt), ARN largo no codificante (ARNln) y ARNm fragmentado. El ARNm codificante (ARNm) se ha identificado en transcriptomas que varían de 200 a 1000 nucleótidos de longitud. El ARNm se puede traducir en proteínas y el miARN puede regular la traducción del ARNm diana en la célula receptora. La cantidad y naturaleza del ARN en los vehículos eléctricos puede variar según el tipo de célula del que se originan.

Debido a que conservan su función en las células receptoras, los investigadores han planteado la interesante hipótesis de que pueden existir mecanismos especializados para asignar diferentes ARN para el transporte de EV a células receptoras específicas, o pueden utilizar estos mecanismos para entregar ARN terapéutico a sitios específicos. . Esta es un área de investigación activa y se han realizado varias revisiones que la abordan.

Las investigaciones de los últimos años han descubierto que los vehículos eléctricos contienen una proporción considerable de ARNm de células madre, muchos de los cuales son ARNm específicos de células. Estas moléculas de ARNm suelen estar presentes en los vehículos eléctricos en forma fragmentada, lo que los protege de la degradación por las RNasas y los convierte en potentes biomarcadores circulantes.

Además, se ha confirmado en múltiples estudios que algunas moléculas de ARNm de <2 kb en los vehículos eléctricos pueden codificar polipéptidos que apoyan la síntesis de proteínas (es decir, la función de traducción de proteínas). Estos estudios enfatizan el papel de los vehículos eléctricos como mensajeros celulares específicos que afectan a las células receptoras y promueven la comunicación intercelular.

El miARN es un tipo de ARN pequeño no codificante (generalmente de 17 a 24 nucleótidos) que normalmente media en el silenciamiento génico postranscripcional dirigiéndose a la región 3' no traducida del ARNm. Al inhibir la traducción de proteínas, los miARN EV son poderosos reguladores de muchos procesos biológicos. A diferencia del ARNm circulante en los vehículos eléctricos, el miARN puede existir en múltiples formas estables en los fluidos corporales. Además de encapsularse en vehículos eléctricos, los miARN circulantes también pueden cargarse en lipoproteínas de alta densidad o unirse a la proteína AGO2 fuera de las vesículas. La evidencia actual sugiere que, aunque la mayoría de los miARN circulantes están unidos a proteínas de unión a ARN, también se encuentran pequeñas cantidades de miARN en los vehículos eléctricos. Sin embargo, la distribución de miARN en los vehículos eléctricos sigue sin estar clara. Como es el caso del ARNm, la expresión de miARN en los vehículos eléctricos refleja su origen celular pero difiere ligeramente de la de las células madre. Se ha descubierto que algunos miARN se expresan preferentemente en vehículos eléctricos y mantienen su función en las células receptoras para regular la traducción de proteínas. Estudios recientes también han encontrado que el suero fetal bovino, comúnmente utilizado en cultivos de células de mamíferos, puede causar artefactos de miARN durante la preparación de EV in vitro.

A través de NGS, también descubrimos que otros tipos de ARN están presentes en los vehículos eléctricos. Estos ARN incluyen ARNt, ARNr, ARN nuclear pequeño (ARNsn), ARN nucleolar pequeño (ARNsno) y ARN largo no codificante (ARNlnc). Ver tabla arriba.

Estudios recientes indican que algunos vehículos eléctricos pueden contener fragmentos de ADN. Estos ADN son fragmentos de doble hebra que van desde 100 pares de bases (pb) hasta 2,5 k pb, y hay algunos fragmentos de ADN gt asociados de 2,5 k pb fuera del EV.

Estos fragmentos representan el ADN genómico completo y pueden usarse para identificar mutaciones presentes en las células tumorales parentales. Aunque existe evidencia creíble de la presencia de ADN en los vehículos eléctricos, aún no se ha determinado su función.

El ácido nucleico del EV ha sido ampliamente estudiado como un potencial biomarcador circulante y regulador intercelular de receptores. Las herramientas tradicionales de extracción y análisis de ácidos nucleicos han sentado con éxito una base importante para nuestra comprensión de los ácidos nucleicos de los vehículos eléctricos. Debido al bajo contenido de ácidos nucleicos en los vehículos eléctricos, es muy importante desarrollar métodos de extracción eficientes y estrategias de detección sensibles, especialmente para la detección de moléculas objetivo raras en muestras pequeñas.

Con el creciente interés en el uso de ácidos nucleicos de vehículos eléctricos como marcadores de diagnóstico mínimamente invasivos, se han desarrollado nuevas tecnologías de biosensores para hacer que la extracción y el análisis sean más eficientes y rápidos. Muchas de estas nuevas plataformas proporcionan una cuantificación sensible de marcadores de ácido nucleico diana y son capaces de identificar marcadores de enfermedades en contextos biológicos complejos, incluidas incluso mutaciones puntuales de un solo nucleótido. Esto abre muchas oportunidades nuevas para la atención clínica personalizada.

Aunque la PCR tradicional es una técnica potente para detectar mutaciones genéticas/de transcripción (p. ej., mutaciones por deleción de EGFRvIII), su sensibilidad es limitada y tiene muchas deficiencias a la hora de detectar mutaciones de un solo nucleótido. Esta cuestión es particularmente relevante para los vehículos eléctricos porque la proporción de transcripciones mutantes es baja entre la gran cantidad de transcripciones de tipo salvaje. Chen et al. emplearon recientemente una tecnología de PCR digital en gotas (ddPCR) para detectar mutaciones raras en vehículos eléctricos.

Shao et al. desarrollaron recientemente una plataforma de microfluidos integral para el análisis de ácido nucleico de vehículos eléctricos in situ, que integra tres módulos funcionales: enriquecimiento dirigido de vehículos eléctricos, aislamiento de ARN en chip y análisis de ARN en tiempo real. Esta plataforma se llama plataforma de análisis de ARN exosomal inmunomagnético (iMER): utiliza perlas magnéticas funcionalizadas con anticuerpos para aislar vehículos eléctricos específicos del cáncer de vesículas derivadas del huésped y luego escinde las vesículas adsorbidas en perlas inmunomagnéticas en el chip. A medida que el lisado de EV pasa a través del filtro de cuentas de vidrio, el ARN de EV se adsorbe selectivamente y se eluye del filtro para la transcripción inversa y el análisis de qPCR. Para simplificar el proceso de análisis, todos los componentes clave están integrados en un único casete de chip.

A medida que se desarrollaba el sistema, los autores estudiaron dos objetivos de ARNm de la proteína nuclear, MGMT (6-metilguanina).

Los tumores son estructuras complejas que incluyen células malignas y células estromales circundantes, como células endoteliales, fibroblastos y células inmunes. Estudios recientes han demostrado que los vehículos eléctricos promueven la comunicación intercelular en el microambiente tumoral, regulando así la aparición y el desarrollo de enfermedades y desempeñando un papel importante en la respuesta terapéutica.

Si estás interesado en otros contenidos de esta gran pieza, puedes leer el documento original.

Existe un modelo similar de progresión de la enfermedad en la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas (p. ej., enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, demencia frontotemporal), en la que las proteínas mal plegadas se autoasocian para formar agregados ordenados y se ensamblan en células.

La formación del péptido Abeta de amiloide es quizás el más conocido de estos agregados proteicos en la enfermedad de Alzheimer (EA). En la enfermedad de Parkinson (EP), se forma otro tipo de agregado dentro de las células, compuesto principalmente de alfa-sinucleína, llamados cuerpos de Lewy. Estudios recientes han demostrado que en los vehículos eléctricos están presentes proteínas mal plegadas implicadas en muchas enfermedades neurodegenerativas. Por tanto, estas vesículas ofrecen una nueva esperanza para detectar y controlar enfermedades neurodegenerativas.

La EA es una enfermedad neurológica de aparición tardía: una pérdida progresiva de memoria y capacidades cognitivas debido a la neurodegeneración. Aunque la causa exacta de la EA sigue siendo un tema controvertido, está claro que la deposición de placa asociada con el péptido Aβ y los ovillos neurofibrilares asociados con la proteína tau son importantes para la progresión de la enfermedad. Estos péptidos amiloides se originan en el proceso proteolítico de la proteína precursora de amiloide (APP). Esto