La historia del desarrollo de DDRT-PCR

Con el desarrollo de la tecnología PCR se han establecido una serie de nuevas tecnologías y métodos basados ​​en el aislamiento de genes. Como la tecnología de visualización diferencial de ARNm (DDRT-PCR), así como el análisis diferencial representativo (RAD) mejorado, la hibridación sustractiva por supresión (SSH) y la tecnología de visualización diferencial de ARN sustractivo cruzado (RSDD).

La PCR de visualización diferencial se basa en la estructura de la cola de poliadenilación (poliA) en el extremo 3' de la mayoría de los ARNm de eucariotas, por lo que los oligonucleótidos que contienen oligo(dT) se pueden utilizar como cebadores para combinar diferentes ARNm con transcripción inversa. en ADNc. Los fundadores de este método, Liang P y Pardee A, diseñaron y sintetizaron 12 cebadores posteriores, llamados cebadores anclados en 3', basándose en la característica de que las dos primeras bases de la secuencia Poly A tienen solo 12 posibilidades excepto AA'-t. 11Mn al mismo tiempo, para amplificar todas las secuencias de ARNm posibles dentro de 500 pb aguas arriba de poliA, se diseñaron 20 cebadores aleatorios con una longitud de 10 pb en el extremo 5'. El par de cebadores así construido puede producir aproximadamente 20.000 bandas de ADN mediante amplificación por PCR, representando cada banda un tipo de ARNm específico, que normalmente cubre todos los ARNm expresados ​​en un determinado tipo de célula en una determinada etapa de desarrollo. El ADN en las bandas expresadas diferencialmente exclusivas de diferentes tejidos se recupera, se amplifica hasta el contenido requerido y luego se realiza transferencia Southern o transferencia Southern o secuenciación directa para identificar y analizar las bandas expresadas diferencialmente y, finalmente, obtener los genes diana expresados ​​diferencialmente.

En comparación con el cribado diferencial y la hibridación sustractiva, la tecnología de visualización diferencial de ARNm (DDRT-PCR) tiene muchas ventajas: ① rápida y fácil de operar ② debido a la aplicación de la tecnología de amplificación por PCR, puede identificar niveles bajos; genes de nivel con alta sensibilidad El ARNm abundante③ puede comparar simultáneamente las diferencias de expresión génica de dos o más muestras de ARNm de diferentes fuentes.

Aunque la tecnología de visualización diferencial tiene muchas ventajas, todavía existen algunos problemas en el funcionamiento real. Las principales manifestaciones son: ① Hay demasiadas bandas diferenciales, la tasa de falsos positivos llega a 70 y la repetibilidad es alta. pobre y hay una fuerte tendencia a contar el ARNm. ② La longitud molecular de la banda amplificada es más corta, generalmente entre 110 y 450 pb.