¿Por qué es necesario linealizar pPIC9K al transformar la levadura? ¿Por qué difieren las expresiones de la levadura linealizada producida por diferentes sitios de restricción? Gracias
La linealización facilita la inserción y recombinación del gen diana. Generalmente linealizamos en el sitio Sal1, de lo contrario no se puede integrar en el genoma de la levadura mediante recombinación homóloga. En términos generales, si elige SacⅠ para la integración lineal, la tasa de recombinación será mayor
El rendimiento de la levadura linealizada producida por diferentes sitios de corte de enzimas es el siguiente
Plásmido recombinante βhCG- Construcción de pPIC9K y transformación de levadura metanófila (Pichia pastoris)
Propósito: Para expresar el antígeno de la vacuna anticonceptiva hCG utilizando tecnología de recombinación genética, construir un plásmido recombinante βhCG-pPIC9K expresado en células de levadura y transformar levadura metanófila. Método: Diseño. dos cebadores basados en la secuencia de ADNc de βhCG, con un sitio de corte de la enzima EcoR I en el sentido ascendente y un sitio de corte de la enzima Not I en el sentido descendente. Utilice el plásmido βhCG-PBS KS como plantilla para realizar una reacción de amplificación por PCR. El fragmento se digirió dos veces con EcoR I y Not I y luego se ligó con el plásmido pPIC9K usando ligasa T4, y luego se introdujo en E. coli DH5α. Se examinaron los clones positivos mediante PCR y se identificó la βhCG-pPIC9K recombinante mediante digestión con doble enzima. Luego se usó electroporación. Transformó la levadura (Pichia pastoris), usó placas MD deficientes en histidina para detectar cepas positivas y detectar cepas insertadas con múltiples copias en medio YPD que contenía G418. Resultado: los cebadores diseñados se usaron para amplificar EcoR I y Not en ambos. El fragmento de ADN de βhCG en el sitio de digestión I se insertó en pPIC9K y se introdujo en DH5α para obtener un clon positivo. La reacción de PCR y la identificación de la digestión enzimática doble mostraron que el plásmido recombinante era βhCG-pPIC9K, y se transformó en levadura metanófila. obtener una cepa tolerante a 4 mg/mL de G418. Conclusión: Se construyó el plásmido recombinante βhCG-pPIC9K y se realizó la electroforesis comparativa antes y. después de linealizar la levadura. La banda cortada debe correr lentamente, con el plásmido intacto al frente. Si la digestión es incompleta, habrá dos bandas en el carril linealizado, una de las cuales es igual que el plásmido.
Además, son factibles métodos de recuperación de cloroformo y etanol.
1. Añadir un volumen igual de fenol cloroformo, mezclar suavemente por inversión, centrifugar a 10000g durante 5 minutos, tomar el sobrenadante y repetir la extracción con fenol cloroformo tres veces.
2. Añadir 2,5 veces el volumen de etanol absoluto y 1/10 de NaAc 3M, mezclar bien, centrifugar a 10000g durante 2 minutos y eliminar el sobrenadante.
3. Añadir etanol al 80% al precipitado, enjuagar, centrifugar ligeramente a 10.000g, eliminar el sobrenadante y repetir tres veces.
4. Seque de forma natural, agregue 10 ul (volumen de digestión enzimática de 50 ul) de agua libre de enzimas, diluya 1 ul 10 veces para la detección por electroforesis y almacene el resto a -80 °C.