¿Cuál es el principio de la electroforesis SDS-PAGE?

Principio de acción: La electroforesis en gel de poliacrilamida es una estructura de red con efecto de tamiz molecular. Viene en dos formas: una es un gel de poliacrilamida no desnaturalizante, en el que las proteínas permanecen intactas durante la electroforesis, en el que las proteínas se separan en función de tres factores: tamaño, forma y carga de la proteína.

Sin embargo, SDS-PAGE sólo separa proteínas en función de sus subunidades de peso molecular. Esta técnica fue establecida por primera vez por Shapiro en 1967. Descubrieron que la movilidad electroforética de las subunidades de proteínas depende principalmente del peso molecular de la subunidad, y el factor de carga puede ignorarse después de agregar detergentes iónicos y agentes reductores fuertes al medio de muestra y al gel de acrilamida.

SDS es un detergente aniónico. Como desnaturalizante y solubilizante, puede romper los enlaces de hidrógeno dentro y entre las moléculas, expandir las moléculas y destruir las estructuras secundarias y terciarias de las moléculas de proteínas. Los agentes reductores fuertes, como el mercaptoetanol y el ditiotreitol, pueden romper los enlaces disulfuro entre los residuos de cistina obstaculizados. Después de agregar agente reductor y SDS a la muestra y al gel, las moléculas se despolimerizan en cadenas polipeptídicas y las cadenas laterales de aminoácidos despolimerizadas se combinan con SDS para formar micelas de proteína-SDS, que llevan una gran carga negativa.

SDS-PAGE generalmente utiliza un sistema de buffer discontinuo, que tiene mayor resolución que un sistema de buffer continuo.

El gel concentrado tiene efecto agregante, con pequeña concentración de gel y gran tamaño de poro. Cuando se agrega una muestra diluida a un gel concentrador, se concentra en un área estrecha mediante migración a través del gel de poros grandes. Cuando la solución de muestra y el gel concentrado son tampón TRIS/HCL, el líquido electrolítico es TRIS/glicina. Una vez que comienza la electroforesis, el HCL se disocia en iones de cloruro y la glicina se disocia en una pequeña cantidad de iones de glicina. Las proteínas están cargadas negativamente, por lo que se mueven juntas hacia el polo positivo. Entre ellos, el ion cloruro es el más rápido, el ion glicina es el más lento y la proteína está en el medio. Al inicio de la electroforesis, la movilidad de los iones cloruro es mayor, superando a la de la proteína, por lo que se forma un área de baja conductividad detrás de él. La intensidad del campo eléctrico es inversamente proporcional al área de baja conductividad, generando así un campo eléctrico más alto. fuerza, lo que hace que los iones de proteína y glicina se muevan rápidamente. Se forma una interfaz estable, lo que permite que las proteínas se agreguen cerca de la interfaz en movimiento y se condensen en una capa intermedia.