Traductor de 67 años

2.8.Identificación de la ribonucleasa H En un sistema de reacción de 10 ml, combine el ARN transcrito del gen uidA marcado con fósforo 32, un oligodesoxinucleótido de 50 nm y un tampón Tris-HCl de 40 mmol con un valor de pH de 7,5. 4 mmol de cloruro de magnesio, 1 mmol de DTT y 5 unidades de nucleasa H, mezclar bien y luego mezclar a 37 grados Celsius. Detenga la reacción añadiendo 5 ml de tampón de parada. Los productos de la reacción se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (5) y el gel se colocó sobre papel de filtro Wortmann para la detección por rayos X. Cada producto de reacción de oligodesoxinucleótido se analizó dos veces.

3. Resultados

Análisis in vitro de 3.1. Ribozima del ARN mensajero de uidA

La estructura secundaria del ARN mensajero de uidA (1811 pb) in silico se analizó utilizando RNAdraw (Matzura y Wennborg, 1996). Según el principio NHH, la inclusión de una secuencia GUC en una sola cadena significa que contiene un sitio de escisión de ribozima eficiente (Ohkawa et al., 65438). Kore et al., 1998). Se identificaron siete sitios de escisión de ribozima en el ARN mensajero de uidA. Cuatro de ellos están ubicados en la región 5V (nt 10, 67, 219, 297), 2 están ubicados en la región intermedia (nt 476, 762) y 1 está ubicado en la región 3V (nt 1332; datos no mostrados) . La ribozima actúa en estos sitios (rz4-rz10, consulte la Tabla 1 para obtener más detalles) para realizar la transcripción, y su actividad en la transcripción del ARN mensajero de uidA se detecta cualitativamente. En el experimento se probaron tres sustratos uidA de diferentes longitudes, a saber, Buida short q (NT 1-217), buidAmedQ de tamaño mediano (nt1-1090) y Buida Longq de longitud completa (NT 1-65438). La transcripción de ARN de tres sustratos de diferentes longitudes mostró una disminución gradual de la estabilidad al aumentar la longitud. La investigación de Haendly y McCall (1996) demostró que la adición simultánea del brazo más corto I (5 BP) y del brazo más largo III (10 pb) puede mejorar la actividad de escisión de la ribozima inactivada. Para analizar el efecto de la longitud del brazo pegajoso sobre la actividad de escisión, se construyeron ribozimas rz4 y rz5 respectivamente, es decir, del tipo simétrico (rz4sym y rz5sym) con 10 nucleótidos pegajosos añadidos al brazo I y al brazo III respectivamente. Se agregaron tipos asimétricos (RZ4SYM y RZ5SYM) de 5 nucleótidos y 10 nucleótidos respectivamente. La Figura 3 muestra los resultados de la detección de ribozimas utilizando uidA de cadena corta como sustrato y ribozimas simétricas y asimétricas rz4 y rz5. Los cuatro están disponibles.