Dos documentos en inglés sobre cultivo de tejidos vegetales, con un total de 400 artículos.
★Callo: Originalmente se refiere a un Grupo de células del parénquima formado en la superficie de la herida después de una lesión, pero en cultivo de tejidos se refiere a un grupo de células del parénquima que crecen desordenadamente a partir de explantes en medios de cultivo artificiales.
★Célula vegetal: Cualquier célula vegetal con un núcleo completo tiene toda la información genética necesaria para formar una perla vegetal completa y tiene la capacidad de desarrollarse hasta convertirse en una planta completa. (Haberlandt, 1902)
★Micropropagación (rápida):
Planta madre (completa) → explante (una pequeña parte de la planta madre, las semillas también son aceptables) →Inocular en el medio de cultivo →Cultivar yemas (subcultivo) →Cultivar raíces (también se puede utilizar para enraizar en tubos de ensayo) →Tomar plántulas y domesticar →Plantas completas.
★Una breve historia del desarrollo del cultivo de tejidos: teoría celular: Schleiden y Schwan. 1. Exploración: A principios del siglo XX, Haberlandt propuso la "totipotencia celular" (1902, Hanning cultivó con éxito embriones de rábano y rábano picante); Laibach (1925, 1929) cultivó con éxito embriones híbridos interespecíficos de lino, demostrando que el cultivo de embriones puede utilizarse para la hibridación a distancia de plantas. En 1922, Robiins (EE.UU.) y Kotte (Alemania) cultivaron con éxito in vitro. 2. Fundación: Gautheret, White y Nobecourt, fundadores del cultivo de tejidos. White y Gautrey descubrieron la vitamina B y las auxinas; Skoog (1944) y Skoog y Cui (1951) encontraron que la proporción de adenina y auxina controla la formación de brotes y raíces. la primera vez. ) Como aditivo, Steward et al. también utilizaron CM en cultivo de tejido de zanahoria. En 1952, Morel y Martin demostraron por primera vez que se podían obtener plantas libres de virus cultivando in vitro las puntas de los brotes. En 1953-1954, el cultivo haploide de Muir tuvo éxito; en 1955, Miller aisló la cinetina (KT); en 1957, Skoog y Miller propusieron el concepto de hormonas vegetales que controlan la formación de órganos, y Steward confirmó por primera vez la idea de las células de Haberlandt; totipotencia; Vickerson y Thurman demostraron que CTK rompió la latencia en yemas axilares; Shigeru Murura desarrolló técnicas de propagación rápida en 1958-1959; Reinert y Steward formaron embriones somáticos en cultivo de callos de zanahoria; 3. Desarrollo rápido: en 1971, Takebe obtuvo por primera vez plantas regeneradas a partir de protoplastos de tabaco; Carlson obtuvo el primer híbrido de células somáticas de tabaco en 1972; Guha y Maheshwari cultivaron embriones de anteras in vitro; En 1960, Morel propuso la reproducción asexual de las orquídeas in vitro. .....(Consulte el libro o el material didáctico para obtener más detalles)
★La importancia del cultivo de tejidos: 1. Investigación teórica básica (la precisión y repetibilidad de los sistemas experimentales se utilizan ampliamente en estudios de fisiología metabólica y otros aspectos bioquímicos de células y tejidos (como la diferenciación)). 2. Investigación aplicada (propagación rápida de clones, comercialización de plántulas de probeta, mejoramiento genético, preservación de germoplasma, superación de la hibridación a distancia, innovación de recursos de germoplasma y obtención de plantas transgénicas).
★Perspectivas de aplicación del cultivo de tejidos: 1. Aplicación en el mejoramiento de cultivos (1. Cultivo de anteras y polen 2. Cultivo de embriones 3. Fusión celular 4. Ingeniería genética 5. Cultivo de células mutantes 6. Preservación de germoplasma) 2 Aplicación en la propagación rápida y libre de virus de cultivos (papas, orquídeas) 3. Aplicación en la producción de productos vegetales útiles 4. Aplicación en la conservación genética, fisiológica y de germoplasma.
★Regulación de hormonas vegetales: auxina/CTK>1 (promueve el enraizamiento);=1 (callo);<1 (promueve la germinación)
★Desdiferenciación: en tejido Durante el cultivo, no Las células en reposo en división se colocan en un medio determinado y luego las células entran nuevamente en estado de división. El proceso por el cual las células maduras se convierten en meristemas se llama desdiferenciación.
★Rediferenciación: Después de la desdiferenciación, una célula vegetal madura se puede rediferenciar para formar una planta completa.
★Vías de rediferenciación: 1. Modo de organogénesis (se refiere a la formación independiente de tallos, yemas y raíces en diferentes partes del explante o callo, que son estructuras unipolares, cada una con haces vasculares y explantes) O callo está conectado, pero no existe * * * el mismo haz vascular entre los brotes adventicios y las raíces adventicias para conectarlos.) 2. Modo de embriogénesis (los explantes producen cuerpos embrioides directamente o mediante callo o cultivo en suspensión).
★ Cuerpo embrioide: se refiere a una estructura embrionaria bipolar que se origina a partir de células no cigóticas en cultivo de tejidos y se forma mediante embriogénesis y desarrollo embrionario. Sus características son: 1. Se diferencia del embrión cigoto porque no se produce por la fusión de células bisexuales. 2. Se diferencia de la partenogénesis/embrión masculino porque no es producto de la apomixis. 3. Se diferencia de los tallos, yemas y raíces formadas por organogénesis porque sufre un proceso de desarrollo similar al del embrión cigótico, y el cuerpo embrioide maduro es bipolar.
★Vía de organogénesis: 1. Cultivar la punta del tallo o segmento del tallo para producir yemas axilares. 2. Generación directa de yemas adventicias: cultivar pequeños trozos de tejido orgánico en el medio de cultivo para inducir directamente yemas adventicias. 3. Formación indirecta de yemas adventicias: después de cultivar pequeños trozos de órganos en el medio de cultivo, se desdiferencian para formar callos y luego se diferencian para inducir yemas o raíces adventicias.
★Métodos de embriogénesis: 1. Embriogénesis directa (diferenciación directa en embriones a partir de órganos, tejidos, células o protoplastos en cultivo, sin callos de por medio) 2. Embriogénesis indirecta (explantación El cuerpo primero se convierte en callo y luego se diferencia y madura a partir de células callosas).
Embriones globales)→Embriones en etapa cardíaca)→ →Embriones en etapa torpedo)→ →Embriones en etapa unicelular.
★Semillas artificiales: se refiere al uso de la totipotencia celular para envolver células somáticas o tejidos meristemáticos (cuerpos embrioides, tallos y segmentos de tallo) producidos por cultivo in vitro en una membrana externa protectora que contiene nutrientes, formando pequeñas cantidades. partículas que pueden convertirse en plantas completas en condiciones adecuadas.
La estructura incluye tegumento artificial, cuerpo embrioide (meristemo) y endospermo artificial.
★Pasos de aplicación del cultivo de tejidos vegetales: 1. Obtener explantes estériles y establecer un sistema de cultivo estéril. 2. Proliferar y producir continuamente yemas adventicias o cuerpos embrioides. 3. Cultura de arraigo. 4. Trasplante de plántulas en probeta.
★Principios de selección del explante: 1. Debe contener células viables. 2. Los tejidos jóvenes contienen una alta proporción de células en división activa. 3. Las cuentas madre deben estar sanas y no mostrar signos de descomposición o enfermedad. 4. Las cuentas madre deben crecer activamente y no entrar inmediatamente en un estado inactivo.
★Selección de explantes: 1. Puntas de tallo (más comúnmente utilizadas para el cultivo de tejidos de plantas hortícolas, con alta tasa de reproducción y variación genética difícil, pero materiales limitados 2. Segmentos de tallo (use segmentos de tallo tiernos); Promover la germinación de yemas axilares, fáciles de obtener); 3. Hojas (el tejido de las hojas jóvenes se diferencia de los callos o yemas adventicias para producir plantas, fáciles de obtener y operar, pero fáciles de mutar 4. Cuajadas y yemas florales; 5. Semillas); , raíces, tubérculos, pétalos, etc.
★Principio de desinfección: el desinfectante debe estar en contacto con el explante durante mucho tiempo para eliminar los microorganismos de la superficie del explante, pero se debe minimizar el daño a las células del explante.
★Método de desinfección: Enjuague el material vegetal para eliminar partículas del mismo tamaño que el suelo → Remoje en etanol al 70-75%, lo cual es beneficioso para humedecer la superficie de la planta → Use una solución de NaClO al 5-20% ( agregar 1 gota de surfactante) Desinfectar la superficie durante 5-10 minutos → enjuagar con agua esterilizada al menos 3 veces → cortar la sección que ha estado en contacto con el desinfectante y luego transferir a medio de cultivo estéril. Porque los desinfectantes matarán las células expuestas, lo que afectará la absorción de nutrientes → Corte los explantes, generalmente segmentos de tallo de 10 mm y hojas de 10 mm (las hormonas que son demasiado grandes debilitarán el efecto y las demasiado pequeñas no sobrevivirán).
★Precauciones de desinfección: 1. Los desinfectantes de superficies son perjudiciales para los tejidos vegetales y la concentración y el tiempo de tratamiento del desinfectante deben seleccionarse correctamente para reducir la muerte del tejido. 2. Después de desinfectar la superficie del material, se debe enjuagar con agua esterilizada más de 3 veces para eliminar el bactericida residual, sin embargo, si se utiliza alcohol para la desinfección, no es necesario enjuagar. 3. Las superficies cortadas que hayan estado en contacto con desinfectantes deben eliminarse antes de transferirlas a sustratos estériles, ya que los desinfectantes pueden dificultar la absorción de nutrientes del sustrato por parte de las células vegetales. 4. Cuando el explante esté gravemente contaminado, se debe lavar con agua corriente durante más de 1 hora, o se deben cultivar primero las semillas para obtener plántulas estériles y luego se debe utilizar cada parte del explante para establecer un cultivo de tejidos. 5.El HgCl2 tiene el mejor efecto, pero es el más dañino para las personas. Después de su uso se debe enjuagar con agua al menos 5 veces.
★ Cultivo de la punta del brote: corte la parte de la punta del brote o la parte del meristemo del tallo para un cultivo estéril.
Pasos: Establecer cultivo estéril → Inducción de yemas → Cultivo de enraizamiento → Trasplante de plántulas probeta (variación genética).
Notas: Durante el proceso de trasplante de plántulas de probeta, de heterótrofas a autótrofas, de temperatura constante a diferencia de temperatura, de estériles a bacterianas, con poca luz, de alta humedad a baja humedad, el equilibrio hídrico de las plántulas debe ser mantenido (añadir film plástico, utilizar pulverizador), elegir un sustrato adecuado, prestar atención a las condiciones de luz y temperatura.
★Anthurium: hojas → inducción de callo → inducción de yema → inducción de raíz.
↓ ↑
Proliferación → corte de raíces → proliferación de yemas → recultivo → fortalecimiento de plántulas → antes del enraizamiento.
Inducción de embriones adventicios: sección de tejido → medio que contiene 2,4-D → generación de embriones adventicios → eliminación de medio 2,4-D → embrión esférico → embrión en forma de corazón → embrión en forma de torpedo → planta.
Inducción de yemas adventicias: Para la inducción se utiliza BA, debiendo eliminarse durante los periodos de bulbo, corazón y torpedo.
★La importancia del cultivo de embriones: 1. El cultivo de embriones in vitro de materiales con endospermo poco desarrollado o incompatibilidad entre el embrión y el endospermo es útil para el éxito de la hibridación a distancia. 2. Esto brinda una gran oportunidad para estudiar las necesidades nutricionales de los embriones en diferentes etapas de desarrollo. 3. Se puede estudiar el potencial regenerativo de todo el embrión y de sus partes.
★Dos cuestiones importantes en el cultivo de embriones: 1. Método de pelado de embriones: el mejor momento para pelar los embriones es entre 13 y 15 días después de la polinización. 2. La composición del medio de cultivo: busque un medio de cultivo adecuado y agregue sacarosa (energía para mantener la presión osmótica adecuada) en el cultivo de embriones.
★Otro método de cultivo:
Ubicación: Invernadero de Dachuan.
Materiales: La mayoría son cultivos de polen mononucleares, y la frecuencia de inducción de callos o cuerpos embrioides es alta.
Para determinar el estadio del polen: a menudo se utiliza la tinción con acetato de fucsina y yoduro de potasio, seguida de un examen microscópico. En la práctica, a menudo se determina basándose en la correlación entre la longitud y el tamaño de las yemas y la edad del polen.
Pretratamiento: baja temperatura, alta temperatura o procesamiento cruzado
Medio: MS, Nitsch, Miller, B5, N6. La auxina en baja concentración se combina con la citoquinina y la sacarosa en alta concentración tiene cierto efecto sobre el crecimiento inducido por el polen. Agregar carbón activado al medio de cultivo también tiene cierto efecto en el aumento de la frecuencia de inducción.
Desinfección, inoculación y cultivo: anteras → trituración en vaso de precipitado (con disolvente) → filtración → centrifugación en gradiente de concentración → recogida de la capa media → centrifugación.
Identificación de haploides y tratamiento de duplicación: Trate el haploide con colchicina al 2% durante 24 horas y las células del callo se duplicarán de forma natural.
★La importancia del polen y el cultivo de anteras: 1. Las células haploides tienen un solo genoma y tienen el mismo fenotipo y genotipo. Una vez que se produce una mutación, ya sea dominante o recesiva, puede expresarse en la generación contemporánea, por lo que los haploides son materiales ideales para la investigación genética somática y el mejoramiento de mutaciones. 2. Durante el proceso de cruzamiento interespecífico, las anteras de la generación F1 se cultivaron para obtener haploides, que inmediatamente se convirtieron en diploides homocigotos después de duplicar los cromosomas. Desde el cruce hasta la obtención de descendientes híbridos no separados de una sola planta, sólo se necesitan dos generaciones, lo que acorta significativamente el ciclo de reproducción en comparación con la reproducción convencional.
★Otros pasos de cultivo (usando medio NLN modificado):
Antera de generación F1 → formación de microsporas → aislamiento de microsporas → formación de callo → formación de embrión → Planta haploide → Diploide homocigoto.
↓
Embriogénesis → Planta haploide → Duplicación de cromosomas para formar diploide homocigótico.
★Aislamiento de protoplastos: enzimas (celulasa, separasa)
Pasos: Desinfección de la superficie foliar → eliminación de epidermis → fragmentos de hojas flotan en una solución que contiene enzimas y estabilizadores de presión osmótica Medio → Cultivo → Los protoplastos se hunden hasta el fondo del plato de cultivo → Retire la solución enzimática → Mueva los protoplastos a CPW para limpiarlos → Centrifugar → Lave el sustrato dos veces → Resuspender en el medio de cultivo → Retire los individuos pequeños y cuente con un hemocitómetro → Ajuste a la densidad adecuada. resuspender en medio de cultivo.
★Cultivo de protoplastos:
Medio: MS+NAA 2.0 ppm+BA 0.5 ppm+3% sacarosa+9% manitol.
Nota: 1. Después del aislamiento de los protoplastos, estos son muy frágiles y requieren protección con osmoprotectores hasta que se forma la pared celular.
2. Según los diferentes objetos de investigación, ajustar adecuadamente los niveles de auxinas y citoquininas en el medio de cultivo.
Factores que afectan al cultivo de protoplastos: requerimientos de nutrientes (no demasiado NH4++), agente de presión osmótica y densidad del cultivo (105/mL),
Condiciones de almacenamiento (normalmente en un lugar oscuro).
Métodos de cultivo: cultivo en matriz líquida, cultivo en matriz semilíquida, cultivo en matriz sólida y cultivo enfermero.
Pasos del cultivo sólido: Transferir protoplastos al medio de cultivo → Mezclar 1 volumen de medio de cultivo que contiene protoplastos con 1 volumen de medio de cultivo que contiene agarosa (40°C) → Invertir la placa de cultivo, 25 Cultivo a ℃→ La pared celular del protoplasto se regenera y se divide en finos trozos.
Grupos de células → Los grupos de células se subcultivan en matriz de agarosa. El penetrante debe reducirse en el medio de cultivo para facilitar la formación de callos e inducir la diferenciación en raíces y tallos de las plantas.
La importancia del aislamiento y cultivo de protoplastos: 1. La eliminación de las paredes celulares allana el camino para la fusión entre las células vegetales, y las hojas abren el camino para la formación de nuevos híbridos. 2. Los protoplastos pueden absorber ADN exógeno, orgánulos, bacterias o partículas de virus. La combinación de estas características y la totipotencia de las plantas sienta las bases para la modificación genética de las plantas superiores. 3. Obtener clones celulares y excelentes materiales de partida para cultivar mutantes.
★Concepto de fusión de protoplastos: Protoplastos aislados de la misma especie o de diferentes especies se fusionan en condiciones adecuadas para obtener una mezcla de materiales nucleares y citoplasmáticos.
★Hibridación de células somáticas: El método de creación de híbridos mediante la fusión de células somáticas sin pasar por el proceso sexual en absoluto se denomina hibridación de células somáticas.
★Métodos de fusión de protoplastos: fusión espontánea, fusión inducida (tratamiento con NaNO3, tratamiento con iones de calcio de alta concentración y pH alto, tratamiento con PEG, electrofusión).
Método PEG:
Aislamiento de protoplastos de hojas verdes (1). 2. Protoplastos incoloros aislados de cultivos en suspensión celular de la misma o diferente especie) para que puedan distinguirse los heterocariones y las células madre.
→Tomar 4 ml de protoplastos suspendidos y cultivados en CPW que contenga 13% de manitol (densidad 2×105), mezclar, centrifugar a 100g durante 105min y colocar los protoplastos en un sustrato al 0,5% →Añadir 2ml 30% (p/v) PEG para preparar protoplastos. Después de cada dilución, resuspender los protoplastos agitando suavemente → centrifugar la mezcla a 65438 ± 000 g durante 65438 ± 00 min y lavar en medio libre de PEG → centrifugar y resuspender en el mismo medio.
Desventajas del método PEG: Tóxico, baja tasa de fusión: inferior al 1%.
Fusión simétrica: Los padres no la han procesado, y el aporte a la descendencia es el mismo.
Fusión asimétrica: los padres aportan de forma diferente a su descendencia, radioterapia y quimioterapia.
IOA (no afecta la división nuclear, pero sí afecta la división citoplasmática)
★Híbrido citoplasmático: utilizando tecnología de fusión de protoplastos, dos componentes genéticos extranucleares (orgánulos) de diferentes fuentes se combinan en uno Los genomas nucleares específicos de cada especie se combinan para formar híbridos citoplasmáticos.
Métodos de identificación de híbridos somáticos e híbridos citoplasmáticos: morfología, citología y genética molecular.
★Plantas hortícolas libres de virus:
Tratamiento térmico desintoxicante:
Principio: A temperaturas superiores a lo normal, muchos virus en los tejidos vegetales pueden ser total o parcialmente Contundente, pero muy poco o ningún daño al tejido huésped.
Métodos: tratamiento con agua caliente (favorable para cogollos inactivos) y tratamiento con aire caliente (favorable para puntas de brotes en crecimiento activo).
Terapia de aire caliente: La temperatura del aire es de 35-40°C, y la duración varía dependiendo del objeto de tratamiento, pudiendo ir desde minutos hasta semanas.
Nota: No lo pongas a temperatura alta de una vez, debes adaptarte poco a poco. Y mantener la humedad y la luz.
Restricciones: 1. No todos los virus son sensibles al tratamiento térmico.
2. Eficaz contra enfermedades causadas por virus y Bacteroidetes del mismo diámetro y rosca.
3. Sólo unas pocas plantas pueden sobrevivir después del tratamiento térmico.
★ Meristemo apical del vástago: se refiere a la parte situada por encima de la base del tallo más joven, con un diámetro máximo de unas 100 μm y una longitud máxima de .
250 micras.
★ Punta del brote: compuesta por el meristemo apical y los primordios de 1-3 hojas inferiores.
★Cultivo libre de virus de la punta del tallo:
Principio: La distribución de los virus en las plantas es desigual. En las plantas infectadas, el meristemo apical generalmente no contiene virus o solo contiene concentraciones bajas, y otros tejidos vegetales tienen mayor contenido de virus cuanto más lejos de la punta del brote.
Factores que afectan el efecto de desintoxicación del cultivo de puntas de brotes: tamaño medio del explante (el efecto de desintoxicación se correlaciona negativamente con el tamaño del explante y la tasa de supervivencia de las puntas de los brotes se correlaciona positivamente con el tamaño de las puntas de los brotes), condiciones de almacenamiento (luz el cultivo es mejor que el cultivo oscuro), el estado fisiológico de los explantes (las yemas en crecimiento están activas, las yemas terminales son mejores que las axilares, el tiempo de corte de las yemas).
★Desintoxicación del cultivo de callos:
Principio: En los callos formados a partir de tejido infectado, no todas las células transportan patógenos de manera uniforme.
Razón: 1. La velocidad de replicación del virus no puede seguir el ritmo de la velocidad de proliferación de las células.
2. Algunas células adquieren propiedades antivirales mediante mutación.
★Identificación de plantas libres de virus: Método de juicio de apariencia, método de planta indicadora (método de identificación por inoculación), método de identificación de antisuero, método de microscopía electrónica,
Espectrofotometría, adsorción por inmunoensayo ligado a enzimas método.
Método de planta indicadora: Utilizar los puntos muertos producidos por el virus en otras plantas como estándar para identificar el virus.
Plantas indicadoras: Los huéspedes seleccionados específicamente para la producción de lesiones locales se denominan plantas indicadoras.
★Conservación de semillas originales no tóxicas: Plante las semillas en suelo estéril en un invernadero o cubierta a prueba de insectos, en un área de aislamiento, y propague mediante cultivo de tejidos.
Controles comunes inglés-chinos para cultivo de tejidos
Aborto (aborto) Adenina (adenina) Agar (agar) Antera (polen) Superior (estéril) Auxina (auxina) Axilar (yema axilar) ) callo, callo (callo) celular (totipotencia celular) celulasa (celulasa) celulosa (celulosa) centrifugación (centrífuga) cloroplasto (cloroplasto) duplicación de cromosomas (duplicación de cromosomas) ) colonia (masa celular, colonia) híbrido citoplasmático (híbrido de citocromo, híbrido citoplasmático) citoquinina (citoquinina) citoplasma (citoplasma) degeneración (aborto) desdiferenciación (desdiferenciación) rediferenciación (rediferenciación) especie doble Dentro dentro de especies dentro de especies dentro de especies dentro de especies dentro de especies dentro de especies dentro de especies dentro de especies dentro de especies dentro de especies dentro de especies dentro de especies dentro de especies dentro especies Dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de las especies dentro de especie dentro de especie dentro de especie dentro de especie dentro de especie dentro de especie dentro de especie dentro de especie dentro de especie dentro de especie dentro de especie Intraespecífica Intraespecífica Intraespecífica Intraespecífica Intraespecífica Intraespecífica Intraespecífica Cinetina (cultivo de puntas de brotes) Micropropagación Microsporas Monocotiledóneas (Moncotiledóneas) Cultivo de nodos (cultivo de segmento de tallo) células de órganos (orgánulos) organogénesis (ósmosis) médula (médula) plántulas (plántulas, plántulas) cultivo de polen polinización protobulbo (PLB) fusión de protoplasma propagación rápida regeneración autoincompatibilidad brote ápice agua oxígeno Cloruro (naclo) embrión somático (embrión somático) híbrido somático (somático híbrido) cultivo de tallo (cultivo de puntas de brotes) desinfectante (desinfectante)
Abreviaturas comunes
ABA (ácido abscísico) CM (jugo de coco) CPW (solución limpiadora de protoplastos celulares)
Dimetilsulfóxido ácido indol acético ácido indol butírico
Cinetina NAA naftaleno Acetato de polietilenglicol
LH (nitrógeno líquido) CH (caseína hidrolizada) GA3 (giberelina)